WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Создание иммунохимических реагентов для выявления caga-антигена helicobacter pylori и антител против него

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КЛИМОВИЧ

Александр Владимирович

СОЗДАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ CagA-АНТИГЕНА HELICOBACTER PYLORI

И АНТИТЕЛ ПРОТИВ НЕГО

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2010

Работа выполнена в Федеральном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» и в Федеральном государственном учреждении «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Самойлович Марина Платоновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «___» ________ 2010 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан «___»__________ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Суворов А.Н.

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунохимические методы анализа приобретают всё большее значение в диагностике инфекционных заболеваний человека. Они позволяют выявлять антигены возбудителя, характеризовать его фенотип и патогенетический потенциал, а также оценивать иммунный ответ организма и исследовать его механизмы.

Инфекция бактерией Helicobacter pylori вызывает развитие в слизистой желудка воспалительного процесса, который в большинстве случаев протекает в форме хронического гастрита. В ряде случаев (до 20%) инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы (Жебрун, 2006; Kusters et al., 2006). Наиболее выраженные патологические процессы, сопряженные с повышенной вероятностью опухолевой трансформации, вызывают штаммы H. pylori, экспрессирующие цитотоксин CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005). Этот белок признан одним из основных факторов патогенности H. pylori и считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (Brandt et al., 2005; Hatakeyama, 2008; Costa et al., 2009). Цитотоксин CagA является вариабельным белком, и в популяции носителей инфекции H. pylori циркулируют штаммы бактерии, экспрессирующие CagA-белок «западного» или «восточноазиатского» типов, которые различаются по аминокислотной последовательности и биологической активности (Xia et al., 2009).

Инфекции CagA-позитивными штаммами H. pylori сопряжены также с развитием ряда экстрагастральных заболеваний аутоиммунной природы. Антитела против CagA-белка вносят существенный вклад в патогенез иммунной тромбоцитопении (Franceschi et al., 2004; Takahashi et al., 2004). Роль и молекулярные механизмы участия цитотоксина CagA и антител против него в патогенезе других аутоиммунных заболеваний (хроническая уртикария, аутоиммунный тироидит и др.) нуждаются в дальнейшем исследовании (Figura et al., 1999; Bakos, Hillander, 2003; Stasi, Provan, 2008).

До сих пор остаются неизученными свойства CagA-белка как антигена: не выяснена иммуногенность различных эпитопов молекулы, не исследован изотипический спектр антител, вырабатываемых против этого белка.

По заключению ряда экспертов, в том числе III Маастрихтской конференции, для диагностики инфекции H. pylori рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (Malfertheiner et al., 2007; Mishra et al., 2008; Guarner et al., 2010). Поскольку CagA-белок является маркером высокопатогенных штаммов H. pylori, разработка методов иммунодетекции CagA-антигена и антител против него представляется актуальной проблемой клинической иммунологии (Hatakeyama, Higashi, 2005; Megraud, Lehours, 2007; Monteiro et al., 2009). Решение этой проблемы сдерживается отсутствием стандартизованных препаратов антигена CagA и моноклональных антител (МКАТ) против него. До сих пор не существует эффективной технологии выделения и очистки белка CagA из культур H. pylori, что препятствует получению и аттестации МКАТ против этого антигена.

Цель и задачи работы

Цель работы состояла в создании иммунохимических реагентов - антигенов и моноклональных антител - для выявления CagA-белка Helicobacter pylori и антител против него.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. С помощью методов биоинформатики выявить области молекулы CagA, различающиеся по степени консервативности и иммуногенности, и определить участки аминокислотной последовательности для конструирования рекомбинантных фрагментов цитотоксина.
  2. Создать штаммы бактерий Escherichia coli, экспрессирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA H. pylori.
  3. Изучить характер связывания рекомбинантных фрагментов CagA с сывороточными антителами и оценить возможность их использования для исследования антител против цитотоксина в сыворотке крови человека.
  4. С помощью гибридомной технологии создать панель моноклональных антител против высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы CagA.
  5. Изучить эпитопную специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов.
  6. Изучить взаимодействие моноклональных антител с нативным белком CagA из культур бактерий H. pylori и определить методы их применения для выявления цитотоксина.

Основные положения, выносимые на защиту



  1. Анализ аминокислотных последовательностей белков CagA с помощью методов биоинформатики оказался эффективным подходом к конструированию рекомбинантных полипептидов и созданию МКАТ.
  2. Созданные рекомбинантные фрагменты CagA соответствуют изолированным участкам первичной структуры цитотоксина, обладающим разной иммуногенностью, что позволяет получать МКАТ против высоко- и низкоиммуногенных детерминант молекулы CagA.
  3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять антитела против цитотоксина в сыворотках носителей инфекции H. pylori, исследовать их изотипический состав и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA.
  4. Рекомбинантные фрагменты могут служить основой для стандартизации методов количественного определения белка CagA в биологическом материале.
  5. Созданные МКАТ способны взаимодействовать как с рекомбинантными фрагментами CagA, так и с «природным» белком CagA в культурах H. pylori, и позволяют дискриминировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы H. pylori методами иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа.

Новизна и научная значимость работы

В результате молекулярно-генетического типирования клинических изолятов H. pylori впервые осуществлен анализ особенностей молекулярной организации гена cagA штаммов H. pylori, циркулирующих на территории России. В базе данных GenBank депонированы первые последовательности гена cagA российских изолятов бактерии.

Предсказана методами биоинформатики и подтверждена в экспериментах разная иммуногенность отдельных участков молекулы CagA.

Созданы штаммы Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты цитотоксина CagA, которые в совокупности воспроизводят всю аминокислотную последовательность этого белка.

Впервые создана панель МКАТ, распознающих антигенные детерминанты высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы цитотоксина CagA.

Впервые предложена система двухцентрового иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления CagA-антигена, основанная на использовании исключительно МКАТ.

Созданные реагенты открывают перспективы для решения ряда научно-исследовательских задач, таких как изучение закономерностей иммунного ответа на цитотоксин, анализ протективной эффективности антител против него, молекулярных механизмов развития язвенной болезни и опухолевой трансформации, роли CagA-белка в патогенезе экстрагастральных аутоиммунных заболеваний.

Практическая значимость работы

На основе полученных рекомбинантных фрагментов CagA белка разработан вариант ИФА для выявления специфических антител в сыворотках носителей высокопатогенных штаммов H. pylori.

Рекомбинантные фрагменты CagA могут быть использованы в качестве контрольных и калибровочных реагентов для различных иммунометрических систем.

Созданные в работе МКАТ против CagA-белка представляют собой основу для разработки и производства диагностических тест-систем, позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных CagA-позитивных штаммов H. pylori, а также контролировать эффективность проводимой терапии.

Внедрение результатов исследования

Разработанные реагенты проходят апробацию в нескольких научных и диагностических лабораториях России, что подтверждается соответствующими документами. На базе Городской больницы №31 (г. Санкт-Петербург) у пациентов с идиопатической тромбоцитопенией и выявленным носительством H. pylori проводится исследование антител, связывающих рекомбинантные фрагменты CagA. В лаборатории аллергодиагностики НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва) разработанные иммунохимические реагенты применяют для анализа взаимосвязи между инфекцией CagA-позитивными штаммами H. pylori и аллергическим иммунным ответом у детей.

Результаты работы используются при проведении практического курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Личный вклад автора в проведение исследования

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Диссертантом выполнены все этапы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных фрагментов CagA, иммунизации экспериментальных животных, получения гибридом, изучения свойств МКАТ, моделирования систем иммуноанализа на их основе. Приготовление меченых МКАТ и антигенов выполнено при участии сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ «РНЦ РХТ». Секвенирование образцов ДНК проведено специалистами компании «АТГ Сервис Ген» (Санкт-Петербург). Культивирование клинических изолятов H. pylori выполнено сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург).





Апробация работы

Материалы работы были представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии: Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции «От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института (Российского Научного Центра Радиологии и Хирургических Технологий)» (Санкт-Петербург, 2008), на XIX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).

Публикации

Результаты работы отражены в 3 статьях и тезисах докладов 4 конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Список цитированной литературы включает 167 литературных источников.

  1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические изоляты H. pylori. В работе использовали 17 культур H. pylori, изолированных из биоптатов стенки желудка, полученных в ходе гастроскопического обследования пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка. Культуры были предоставлены сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург).

Образцы сывороток. Образцы сыворотки крови субъективно здоровых доноров и пациентов с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки (всего 80 образцов) были получены из НИЛ «Диагностика» и Городской больницы №31 (Санкт-Петербург).

Лабораторные животные. В работе использованы мыши гибриды F1(SJL/JxBALB/c), полученные в результате межлинейного скрещивания в виварии РНЦ РХТ.

Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. С помощью множественного выравнивания (алгоритм ClustalW) 39 полноразмерных аминокислотных последовательностей CagA, аннотированных в базе данных GenBank, в молекуле цитотоксина выявлены консервативные и вариабельные области. С использованием алгоритма Paircoil (Berger et al., 1995) исследовали распределение вероятности образования суперскрученной альфа-спирали в аминокислотной последовательности CagA. Участки аминокислотной последовательности, которые образуют суперскрученную спираль, характеризуются высокой иммуногенностью (Cooper et al., 1997). Значения вероятности образования суперспирали выше уровня 0,5 считали показателем потенциально высокой иммуногенности соответствующего участка молекулы CagA. Области, характеризующиеся низким уровнем вероятности (<0,5) рассматривали как низкоиммуногенные. На основе этих данных определяли участки молекулы CagA для конструирования и экспрессии рекомбинантных фрагментов цитотоксина. С помощью анализа нуклеотидных последовательностей cagA, аннотированных в GenBank, в программах Vector NTI Advanced 11 и Primer 3 0.4.0 (Rozen, Skaletsky, 2000) сконструированы 6 специфических олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов гена cagA: Для обеспечения направленного клонирования ПЦР-продуктов в 3`-область последовательности смысловых праймеров (cagA1F 5`-TTCATAGGATCCTGATCAAAAATCAATCG-3`, cagA2F 5`-TTGAGGATCCTAATTTCAAATACACCAACG-3`, cagA3F 5`-ATATGGATCCGTTAAGAATGGTGTG-3`) был включен сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы BamHI, в антисмысловые праймеры (cagA1R 5`-TTTTCACTGCAGCATAATTGCCTGTG-3`, cagA2R 5`-ATTTCTGCAGTTACCTTCTTAGCAACTTG-3`, cagA3R 5`-ATGCTCTGCAGTTTCTCTCGCCAAGCAGT-3`) – сайт узнавания PstI.

Конструирование и экспрессия рекомбинантных фрагментов CagA-белка. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице тотальной ДНК из биоптатов стенки желудка носителей H. pylori амплифицировали фрагменты гена сagA, которые затем клонировали в экспрессионные плазмидные векторы pQE30 и pQE31 (Qiagen). Полученные генетические конструкции реплицировали в бактериях E. coli TOP10F` (Invitrogen), анализировали секвенированием и использовали для трансформации бактерий E. coli линии M15[pREP4] (Qiagen) методом электропорации. Экспрессию рекомбинантных белков индуцировали внесением изопропил-бета-D-тиогалактозида и контролировали с помощью электрофореза в денатурирующем акриламидном геле (ДСН-ПААГ, Laemmli, 1970) и иммуноблоттинга с МКАТ против 6xHis-мотива (Novagen). Белки очищали методом металл-хелатной аффинной хроматографии в денатурирующих условиях на Ni-NTA-агарозе (Qiagen) в присутствии мочевины. Концентрацию белка в пробах измеряли по методу Брэдфорда и Лоури. Чистоту фракций оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и денситометрического анализа фореграмм в пакете программ GelPro 3.1.

Молекулярно-генетическое типирование изолятов H. pylori. Из культур клинических изолятов H. pylori выделяли геномную ДНК и проводили амплификацию фрагментов гена cagA методом ПЦР (Panayotopoulou et al., 2007). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенирования.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.