WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Роль перитонеальных факторов в регуляции инвазивности и апоптоза эндометриальных клеток при наружном генитальном эндометриозе

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ФИЛИППОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

РОЛЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИНВАЗИВНОСТИ И АПОПТОЗА ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ

НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ

14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Козлов Иван Генрихович

доктор медицинских наук,

профессор Гариб Фируз Юсуфович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «17» октября 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «23» июня 2011 года

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т. Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наружный генитальный эндометриоз, одно из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, характеризуется ростом эндометриальной ткани вне полости матки, преимущественно в перитонеальной полости, и является причиной развития у пациенток болевого синдрома и бесплодия (Vinatier D., e.a, 2000; Nap A.., e.a., 2004; Rodgers P.A., е.а., 2009). Гипотеза о важной роли иммунных нарушений в развитии эндометриоидных гетеротопий получила в последние годы широкое распространение (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Анциферова Ю.С. с соавт., 2007; Iwabe T., e.a., 2000; Lebovic D.I., e.a., 2001; Berkkanoglu M., Arici A., 2003; Ulukus M, Arici A., 2005; Kyama C.M., e.a., 2009; Velasco I., e.a., 2010).

Развитие и рост эндометриоидных очагов происходит в перитонеальной полости. Известно, что в перитонеальной жидкости содержится большое количество клеток иммунной системы, преимущественно макрофагов, и разнообразных биологически активных веществ, участвующих в регуляции процессов клеточного роста и пролиферации (Vinatier D., e.a., 2001; Yang W.C.V., e.a., 2004; Nap A.., e.a., 2004). У женщин с эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация макрофагов, усилена их активация и продукция ими целого ряда цитокинов и факторов роста (Halme J., e.a., 1987; Gazvani R., Templeton A., 2002; Sidell N., e.a., 2002; Kyama C.M., e.a., 2003; Yang W.C.V., e.a., 2004). Однако до сих пор остается не решенным вопрос о том, почему, несмотря на высокий уровень активации, перитонеальные макрофаги пациенток с эндометриозом не элиминируют из перитонеальной полости гетеротопический эндометрий. В основе этого явления могут лежать нарушения экспрессии макрофагами функциональных рецепторов, а также изменения продукции цитокинов, хотя прямых доказательств этой гипотезы до сих пор не получено.

Эндометриальные клетки у пациенток с эндометриозом обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферацией и инвазивностью (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2007; Vinatier D., e.a., 2000; Brenner R.M., e.a., 2002). Особую роль в обеспечении инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе отводят повышенной продукции протеолитических ферментов из семейства матриксных металлопротеиназ (MMPs) в ткани эндометриоидного очага (Ueda M., e.a., 2002; Alviggi C., e.a., 2004; Chen Q.H., e.a., 2004; Li Y., Lang J.H., 2006; Collette T., e.a., 2006). Однако до сих пор не установлены факторы, которые могут влиять на усиление синтеза ММРs при эндометриозе. Считают, что выживанию эндометрия в перитонеальной полости способствует угнетение апоптоза эндометриальных клеток (Dmowski W.P., e.a., 2004; Nishida M., e.a., 2004; Harada Н., е.а., 2004, 2007; Taniguchi F., e.a., 2011). По данным литературы, фагоциты играют важную роль в индукции апоптоза (Mor G., Abrahams V.M., 2003). Однако участие перитонеальных макрофагов в регуляции апоптоза клеток эндометрия при эндометриозе мало изучено.

Таким образом, выявление участия перитонеальных макрофагов и гуморальных факторов перитонеальной жидкости в обеспечении повышенной жизнеспособности и инвазивности ткани эндометриоидных очагов является актуальной задачей клинической иммунологии, так как позволит уточнить иммунные аспекты формирования и роста гетеротопий.

Цель исследования: установить механизмы участия перитонеальных факторов в регуляции апоптоза и инвазивности эндометриальных клеток при наружном генитальном эндометриозе для выяснения новых патогенетических аспектов эндометриоза



Задачи исследования:

1. Установить особенности функционального состояния перитонеальных макрофагов и содержания кальпротектина, IL-8, и MCP-1 в перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом.

2. Определить особенности экспрессии факторов, регулирующих апоптоз и инвазию (MT-1, XIAP, каспаза-3, ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом.

3. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на апоптоз стромальных клеток и на экспрессию факторов, регулирующих апоптоз (MT-1, XIAP, каспаза-3), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом и здоровых женщин.

4. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на экспрессию генов, регулирующих инвазивность (ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом.

5. Выявить влияние секреторных продуктов перитонеальных макрофагов и перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом на инвазию эндометриальных клеток в матригеле.

Научная новизна исследования

Установлены новые иммунные механизмы, участвующие в развитии и росте эктопического эндометрия в перитонеальной полости пациенток с наружным генитальным эндометриозом.

Показано, что развитие и рост очагов эндометриоза в перитонеальной полости происходят на фоне угнетения экспрессии перитонеальными макрофагами молекул, участвующих в межклеточном взаимодействии, презентации антигена и запуске апоптоза.

Выявлено, что распространенные формы наружного генитального эндометриоза ассоциируются с усилением внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов макрофагами, и повышением содержания в перитонеальной жидкости хемокинов и кальпротектина.

Показано, что развитие эндометриоза связано с нарушением регуляции апоптоза в ткани эндометрия, проявляющимся в повышении синтеза анти-апоптотическиого фактора XIAP в эутопическом эндометрии, усилении экспрессии мРНК каспазы-3 в ткани эндометриодного очага и резком снижении уровня экспрессии мРНК МТ-1 как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом.

Впервые установлено, что у здоровых фертильных женщин макрофаги и растворимые факторы перитонеальной жидкости in vitro усиливают апоптоз эндометриальных стромальных клеток, тогда как у пациенток с эндометриозом перитонеальная жидкость снижает апоптоз эндометриальных стромальных клеток, а перитонеальные макрофаги угнетают экспрессию мРНК регулирующих апоптоз факторов (MT-1, XIAP и каспазы-3) в ткани эутопического эндометрия.

Выявлено усиление инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе за счет изменения баланса в системе ММРs/TIMPs в сторону преобладания активности протеолитических ферментов.

Впервые показано, что факторы перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия, при этом перитонеальная жидкость повышает синтез в ткани эндометрия протеолитического фермента ММР-2, а макрофаги – угнетают экспрессию мРНК антипротеолитических факторов TIMP-1 и TIMP-2.

Впервые выявлено, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом аутологичная перитонеальная жидкость и продуцируемые макрофагами растворимые факторы усиливают инвазию в матригеле клеток эутопического эндометрия.

Практическая значимость результатов исследования

Выявлены новые патогенетические механизмы развития наружного генитального эндометриоза, заключающиеся в уточнении роли перитонеальных факторов в регуляции инвазивности и апоптоза эндометриальных клеток.

Предложены новые дополнительные диагностические критерии степени тяжести наружного генитального эндометриоза, основанные на определении относительного содержания в перитонеальной жидкости уровня IL-8+ перитонеальных макрофагов.

Предложены новые дополнительные диагностические критерии наружного генитального эндометриоза, основанные на определении уровня экспрессии в эндометрии мРНК XIAP.

Положения, выносимые на защиту

Высокий уровень синтеза XIAP в эутопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе обеспечивает повышение жизнеспособности эндометриальных клеток при их попадании в перитонеальную полость, тогда как усиление протеолитической активности ММР-2 и ММР-9 на фоне высокого уровня синтеза каспазы-3 способствует росту эндометриоидного очага.

Снижение экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами и усиление продукции провоспалительных цитокинов приводит к нарушению локального иммунного ответа и изменению микроокружения в перитонеальной полости, вызывая угнетение апоптоза клеток эутопического эндометрия и усиление их инвазивных свойств, что обеспечивает рост гетеротопий.

Апробация работы

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); 90-й Юбилейной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию академии «Неделя науки - 2010» (Иваново, 2010); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» с элементами научной школы для молодежи (Пермь, 2010).





Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Личное участие автора

Автором самостоятельно проводилось выполнение иммунологических исследований. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 8 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 197 источников, в том числе 24 отечественных и 173 иностранных источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова» Минздравсоцразвития России, директор д.м.н. А.И.Малышкина. Исследования проводились в гинекологической клинике, эндоскопическом отделении - зав. к.м.н. В.Н. Романов, лаборатории клинической иммунологии - зав. д.м.н. профессор Н.Ю. Сотникова, лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д.м.н. профессор Л.П. Перетятко.

Всего было обследовано 126 женщин, поступивших в гинекологическую клинику ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова» Минздравсоцразвития России, объединенных в следующие клинические группы: 35 практически здоровых женщин фертильного возраста с реализованной репродуктивной функцией (контрольная группа) и 91 женщина с наружным генитальным эндометриозом, из которых у 62 женщин (68%) был диагностирован эндометриоз I-II степени, а у 29 пациенток (32%) – эндометриоз III - IV степени.

Материалом для исследования служили: перитонеальная жидкость, биоптаты эндометрия из полости матки и ткань эндометриоидных очагов.

Иммунологические методы исследования:

- выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной жидкости стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,078) (Boyum A., 1968);

- выделение обогащенной популяции стромальных клеток из ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин стандартным ферментативным методом (Clover L.M., et. al., 2000);

- определение особенностей экспрессии функциональных молекул на поверхности макрофагов перитонеальной жидкости с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). Характеристика используемых мАТ представлена в Таблице 1. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов проводили процедуру пермеабилизации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, USA). Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, использовали коммерческий набор с Annexin V (CALTAG Laboratories, USA). Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickonson, USA).

Таблица 1.

Панель мАТ, использованных в исследовании

п/п

мАТ

Клон

Фирма-производитель

Флюорохромная метка

1

CD11b

-

ООО «Сорбент», Москва

FITC

2

CD49e

IIA1

BD Boisceinces, USA

PE

3

CD95

DX2

Caltag Laboratories, USA

PE

4

CD 95L

Alf-2.1

InvitrogenTM, USA

PE

5

CD 86

HA5.2B7

Beckman Coulte, Francer

PE

6

HLA-DR

-

ООО «Сорбент», Москва

PE



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.