WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 |

Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс wistar после введения липополисахарида

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Перекрест София Владимировна

Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс wistar после введения липополисахарида

14.00.16 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2009

Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Академик РАМН

Корнева Елена Андреевна

Официальные оппоненты:

1. Шестакова Светлана Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры Патологической физиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

2. Кветная Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, руководитель лаборатории Биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «22» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н. П.А. Дыбан

общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Одним из перспективных научных направлений, интенсивно развивающихся в мире, является иммунофизиология, рассматривающая процессы взаимодействия нервной и иммунной системы. Особое внимание уделяется роли гипоталамуса в нейроиммунных взаимодействиях, что обуславливается его функциональными особенностями. Как известно, гипоталамус представляет собой центр регуляции многих вегетативных функций, таких как терморегуляция, водно-солевой обмен, пищевое поведение, цикл сон/бодрствование, функций иммунной системы. К настоящему времени открыто и изучено большое количество гипоталамических нейропептидов, принимающих участие в регуляции вегетативных функций организма. Одними из этих нейропептидов являются орексины.

Орексины А и В — нейропептиды, открытые в 1998 году, синтез которых осуществляется небольшой популяцией гипоталамических нейронов от общего пептида-предшественника препроорексина. Орексин-содержащие нейроны участвуют в регуляции различных физиологических процессов (поддержания энергетического баланса, регуляции состояния сна и бодрствования, пищевого поведения, ответных реакций на стресс и восприятие боли) (Beukmann C. et al, 2002; Espana R.A. et al, 2001; Ida T. et al, 1999; Dube M.G. et al, 1999; Ida T. et al., 2000; S. Watanabe et al, 2005; Swanson L.W. et al, 2005).

Основное количество орексин-содержащих нейронов мозга локализовано в перифорникальной зоне латеральной гипоталамической области (Peyron C., 1998). Аксоны этих нейронов достигают различных отделов головного и спинного мозга. Высокая плотность распределения отростков орексин-содержащих нейронов выявлена в гипоталамических структурах (Peyron C., 1998), вовлеченных в регуляцию функций иммунного ответа (переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле, латеральная гипоталамическая область и вентро-медиальное гипоталамическое ядро) (Корнева Е.А., Хай Л.М., 1963; Лесников В.А., 1993; Shanin SN et al, 2005; Wenner M. et al, 2000). В этих же структурах локализованы нейроны, имеющие рецепторы к орексину (Hervieu G.J. et al, 2001; Trevedi P., 1998; Taheri S. et al, 1999). Рецепторы к орексину или их мРНК обнаружены и на клетках различных тканей, участвующих в реализации иммунного ответа (клетки селезенки, надпочечников, печени, стволовые клетки фенотипа CD34+) (Randeva H.S. et al, 2001; Zhang S. et al, 2005; Steidl U., 2004).

Установленные к настоящему времени многочисленные факты могут свидетельствовать в пользу возможного участия системы орексин-содержащих нейронов и самого орексина в регуляции функций иммунной системы. Наличие нейро-иммунных взаимодействий не вызывает сомнений, однако механизмы их до сих пор остаются не до конца раскрытыми и нуждаются в дальнейших исследованиях. Известно, что нейроны LHA участвуют в регуляции функций иммунной системы, например, электростимуляция этой области гипоталамуса, где и локализованы орексин-содержащие нейроны, усиливает цитотоксическую активность NK клеток селезенки (Wrona D., 2003; Wenner M. et al, 2000). Нейроны латеральной гипоталамической области также связаны полисинаптически с нейронами, иннервирующими селезенку (Cano G., 2001; Denes A., 2001) и красный костный мозг (Denes A. et al, 2005). Необходимо подчеркнуть, что переднее гипоталамическое ядро, заднее гипоталамическое поле и латеральная гипоталамическая область активируются в первые часы после введения антигенов различной природы, таких как липополисахарид (ЛПС) (Elmquist J.K. et al, 1996; Gaykema R.P.H. et al, 1999; Yi-Hong et al, 2000), столбнячный анатоксин (Корнева ЕА и др., 2001), стафилококковый энтеротоксин В (Gaykema R.P.H. et al, 1998; Goehler L.E. et al, 2001).



Хотя перечисленные факты свидетельствуют в пользу возможного участия орексин-содержащих нейронов и самого орексина в механизмах реализации взаимодействия нервной и иммунной систем, однако прямых доказательств в современной литературе пока не существует. Изучение паттерна активации гипоталамических структур, а также исследование динамики распределения орексин-содежащих нейронов гипоталамуса в первые часы после антигенного воздействия представляется важным этапом для расшифровки этих механизмов на ранней стадии формирования иммунного ответа. Определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса позволяет проанализировать молекулярные механизмы формирования ответа орексин-содержащих нейронов, вовлекающихся в реакции ЦНС на антигенный стимул.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение реакций орексинэргических нейронов гипоталамуса крыс на введение антигена липополисахарида в различных дозах.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать степень активации клеток и структур гипоталамуса (по выявлению c-Fos белка) через 2 часа после внутривенного введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.
  2. Исследовать морфо-функциональные характеристики орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс через 2, 4 и 6 часов после внутривенного введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.
  3. Исследовать уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамических структур крыс через 2, 4 и 6 часов после внутривенного введения липополисахарида в дозе 25 и 500 мкг/кг веса животного.

Научная новизна работы

Впервые получены данные о степени активации гипоталамических структур в ответ на введение антигена липополисахарида в различных дозах (несептической и субсептической). Показано участие орексин-содержащих нейронов в ответных реакциях ЦНС на антигенное воздействие, а также выявлен дозозависимый характер динамики изменений их морфо-функциональных характеристик. Впервые проведен сравнительный анализ изменений уровня экспрессии гена препроорексина и выявление орексина по иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамических структур после введения антигена.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные значимы для раскрытия центральных механизмов нейроиммунных взаимодействий и являются важным этапом в изучении процесса реализации реакции ЦНС на антигенное воздействие, что создает основу для поиска путей коррекции нарушений процессов взаимодействия нервной и иммунной систем.

Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о морфо-функциональных особенностях системы орексинэргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования реакций организма на антигенное воздействие, а также могут быть включены в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Внутривенного введение антигена липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного приводит к активации гипоталамических структур (AHN, PVH, VMH, DMH, LHA, PH), паттерн которой различен, что проявляется индукцией синтеза c-Fos белка в клетках этих структур.
  2. Орексин-содержащие нейроны вовлекаются в ответные реакции ЦНС на введение липополисахарида, что проявляется изменением иммунореактивности этих нейронов, а пространственно-временная динамика изменений их морфо-функциональных характеристик зависит от дозы вводимого антигена.
  3. Внутривенное введение липополисахарида приводит к активации экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса через 2 часа после введения липополисахарида в дозах 25 и 500 мкг/кг веса животного.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных — 13 и 214 — зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.

Апробация работы

Материалы исследования изложены в 12 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях: Х Всероссийский научный форум Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 29 мая – 1 июня 2006); International Symposium Interaction of the nervous and immune systems in health and disease (Saint-Petersburg, 31 May - 2 June 2007); ХХ съезд физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 4-8 июня 2007); Объединенный иммунологический форум (Санкт-Петербург, 30 июня – 5 июля 2008); Международная конференция Физиология и патология иммунной системы (Москва, 14-17 сентября 2008).

материалы и методы исследования

Экспериментальные животные и схема эксперимента





Работа выполнена на 126 крысах, взрослых самцах породы Wistar, весом 250-300 г., адаптированных к условиям эксперимента. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных.

В качестве тимус-независимого антигена, обладающего высокой степенью иммуногенности, использовали липополисахарид (ЛПС) (E.coli 055:B5, Sigma, L2880).

Дозы были подобраны так, чтобы в одном случае (25 мкг/кг веса животного) не вызывать синтез антител, определяемый методом пассивной гемагглютинации, а в другом случае (500 мкг/кг веса животного) приводить к достаточному для определения указанным методом синтезу антител (титр 1/64).

Все инъекции проводили в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в гипоталамусе (Taheri S. et al, 2000). Крысам внутривенно вводили 200 мкл ЛПС в дозе 25 или 500 мкг/кг веса. Контролем служили животные, которым внутривенно вводили физиологический раствор в том же объеме.

Экспериментальные группы:

  • Группа 1. Интактные животные.
  • Группа 2. Контрольные животные, которым внутривенно вводили 200 мкл физиологического раствора.
  • Группа 3. Животные, которым внутривенно вводили 25 мкг/кг липополисахарида.
  • Группа 4. Животные, которым внутривенно вводили 500 мкг/кг липополисахарида.

Выведение животных из эксперимента проводили в 11 часов, а также через 2, 4 и 6 часов после инъекции.

Иммуногистохимическое окрашивание.

Выявление c-Fos- и орексин-позитивных нейронов проводили иммуногистохимичеким методом на фронтальных замороженных срезах мозга (30 мкм). Для выявления c-Fos белка использовали первичные кроличьи поликлональные антитела к семейству c-Fos белков (Santa-Cruz, Biotech.Inc.) и вторичные антитела к кроличьим иммуноглобулинам (IgG), меченые пероксидазой (Sigma). Выявление орексина осуществляли авидин-биотиновым методом. В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела к орексину А (Sigma), в качестве вторичных — моноклональные антитела к кроличьим иммуноглобулинам (клон RG-16), конъюгированные с биотином (Sigma), детекцию которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки (Sigma). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили раствором диаминобензидина.

Подсчет количества клеток.

Подсчет c-Fos-позитивных клеток производили, используя систему Иста-Видео-Тест. Срезы мозга исследовали при 40-кратном увеличении светового микроскопа. С помощью компьютерной программы Иста-Видео-Мастер определяли площадь клеток и среза, на которой проводили подсчет клеток и оптическую плотность окраски клеток и фона для каждого среза. При анализе количества c-Fos позитивных клеток учитывали только те клетки, оптическая плотность которых превышала окраску фона, как минимум, в 1,25 раза и выше, а площадь превышала 10 мкм2. Для сопоставления количества c-Fos позитивных клеток, данные количественных подсчетов пересчитывали на унифицированную площадь, равную 10000 мкм2. Сравнительный анализ степени активации структур гипоталамуса по экспрессии c-Fos-подобного белка проводили по оценке относительного коэффициента активации (ОКА), а также по показателю относительной оптической плотности (ООП), которые высчитывали по формулам:


ОКА=

ООП=

Подсчет орексин-позитивных нейронов осуществляли при 10-кратном увеличении светового микроскопа на всей площади срезов 26-32 уровней. Количество орексин-содержащих нейронов широко варьирует у каждого животного на различных срезах мозга, полученных с одного уровня. Для того чтобы минимизировать случайные ошибки, возникающие при изготовлении срезов, в исследовании учитывали количество орексин-содержащих нейронов на всех срезах мозга конкретного животного.

Полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени.

Для постановки полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR) животных декапитировали и сразу извлекали гипоталамус.

  1. Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad).
  2. Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием реактивов, поставленных компанией «МедиГен».
  3. Полимеразная Цепная Реакция в Реальном Времени (RT-PCR):

Для проведения реакции использовались праймеры:

— к последовательности, кодирующей препроорексин (Ox):

Прямой: 5’-TGT CGC CCA GAA GAC GTG TTC CTG-3’

Обратный: 5’-AAG ACG GGT TCA CAC TCT GGA TC-3’

Температура отжига: 61°С, длина продукта – 287 пар нуклеотидов.

— к последовательности кодирующей глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAD):

Прямой: 5’-CCA CTC AGA AGA CTG TGG AT-3’

Обратный: 5’-GTC ATC ATA CTT GGC AGG TT-3’

Температура отжига: 55°С, длина продукта – 224 пары нуклеотидов.

Праймеры были произведены лабораторией «СинТол».

Наблюдение за ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью компьютерной программы «Opticon Monitor 3.1».

Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и высчитывали по следующей формуле:

IOx= EOx^C(t)Ox/EGAD^C(t)GAD

где: IOx относительный уровень экспрессии гена препроорексина, выраженный в долях от уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы.



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.