WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Троценко Иван Дмитриевич

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.12-онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

http://rncrr.ru

Москва-2012

Работа выполнена в ФГБОУ Российский университет дружбы народов (ректор –академик РАО, профессор В.М. Филиппов) и ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (директор – член–корреспондент РАМН, профессор В.А.Солодкий).

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор Н.В. Харченко

Научный консультант

Доктор медицинских наук, профессор В.К. Боженко

Официальные оппоненты: Ашрафян Лев Андреевич, член-корр. РАМН, профессор, ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития России, руководитель лаборатории комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний
Бабкина Ирина Валентиновна, доктор медицинских наук, ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии

Ведущая организация: ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « 22 » октября 2012 г. в 16 час. на заседании диссертационного совета Д 208.081.01 при ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ Российского университета дружбы народов и ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « 20 » сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор З.С. Цаллагова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является наиболее распространенным онкологическим заболеванием в женской популяции, составляя 20,5% от всех онкологических заболеваний (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011). Одновременно достаточно высокими, до 70%, являются показатели выявляемости заболевания на ранних (I-II) стадиях, что позволяет использовать менее токсичные программы лечения (Харченко В.П., Рожкова Н.И., 2010). С другой стороны, излишне щадящая тактика в отношении онкологических больных связана с риском рецидивирования заболевания.

Выбор тактики лечения при раке молочной железы определяется сочетанием факторов, описывающих такие особенности опухоли как размер образования, наличие метастазов в регионарные лифоузлы, степень злокачественности, пролиферативная активность, оцениваемая по уровню экспрессии белка Ki67 (Jalava P., et al., 2006) и т.д (A. Goldhirsch, W. C. Wood, 2009). При этом, однозначными показаниями для адьювантной химиотерапии принято считать большой размер опухоли (Т>5 см), более 4 метастазов в регионарные лимфоузлы (N2-N3), высокая степень злокачественности (G3) и высокая пролиферативная активность (экспрессия Ki67 более 30%), минимальные значения по данным критериям (Т<2 см, N0, G1, Ki6715%) представляют собой относительные показания для адьювантной гормонотерапии. Однако при размере опухоли от 2.1 до 5 см, наличии метастазов в 1-3 регионарных лимфоузлах (N1), 2 степени злокачественности (G2), экспрессии Ki67 16-30%енобходимость назначения адьювантной химиотерапии является недоказанной. Таким образом, использование «классических» факторов прогноза не всегда позволяет адекватно выделить группу высокого риска рецидивирования.

В многочисленных исследованиях сказано, что исследование экспрессии одного или комплекса генов в ткани опухоли имеет независимое прогностическое значение (Chang, 2007, Cobliegh, 2005, Esteva, 2005, Gianni, 2005, Habel, 2006, Mina, 2006, Paik, 2004, и Paik, 2006). В частности, эксперты конференции StGallen 2011 признают, что использование профиля экспрессии генов OncotypeDXTM, в основе которого лежит оценка экспрессии мРНК 16 генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и клеточной дифференцировки, адекватно отражает биологическую гетерогенность рака молочной железы и может применяться для определения прогноза заболевания и рекомендации назначения химиотерапии (Gnant М., 2011). Таким образом, выявление закономерностей экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в ткани доброкачественных и злокачественных образований может дать новые, более достоверные факторы прогноза и повысить эффективность дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.

Цель работы

Исследовать экспрессию комплекса генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в морфологически неизмененной ткани молочной железы при фиброаденоме и инвазивном раке молочной железы, и определить взаимосвязь их экспрессии с клинико-морфологическими характеристиками доброкачественных и злокачественных опухолей.



Задачи исследования

  • Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при раке молочной железы
  • Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при фиброаденоме молочной железы
  • Провести сравнительный анализ экспрессии генов в образцах рака молочной железы в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли

Научная новизна

Количественно определена экспрессия мРНК 17 генов маркеров пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в неизмененной ткани молочной железы, в ткани фиброаденомы и рака молочной железы на различных стадиях заболевания. Изучена взаимосвязь относительного содержания мРНК исследуемых генов в ткани опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими особенностями опухоли. Впервые оценена связь уровня экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани с морфологическими особенностями рака молочных желез. Получены статистически значимые отличия экспрессии исследуемых генов в зависимости от типа опухоли, а также в зависимости от клинико-морфологических характеристик рака молочной железы. На основании определения и сравнения уровня экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR в ткани рака молочной железы разработан алгоритм, позволяющий выявлять опухоли, имеющие неблагоприятные молекулярно-биологические характеристики.

Научно-практическая значимость

В результате проведенного исследования оценена клиническая значимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК комплекса генов в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной железы. Разработан алгоритм определения изменения направления экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR при раке молочной железы как дополнительный диагностический критерий в комплексной диагностики потенциально более злокачественных опухолей.

Положения, выносимые на защиту

  1. Экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза, клеточных рецепторов и генов межклеточных взаимодействий в образцах инвазивного рака молочной железы значительно повышена по сравнению с морфологически неизмененной тканью и фиброаденомой.
  2. В образцах инвазивного РМЖ при большом размере опухоли, наличии регионарных и отдаленных метастазов повышена экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза и генов межклеточных взаимодействий.
  3. Активность процессов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани связана с уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu опухоли при раке молочной железы.
  4. Сравнительная индивидуальная оценка экспрессии генов в образцах опухоли и морфологически неизмененной ткани дает дополнительную информацию для выявления потенциально более злокачественных опухолей.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены: на II Междисциплинарном форуме «Медицина молочной железы: на стыке специальностей», Москва в 2012 году; Worldwide Innovative Networking in personalized cancer medicine (WIN) 2012, Париж. Апробация работы прошла в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий 09 апреля 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, трех глав, а также выводов и списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 220 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных пациентов.

Исследован уровень экспрессии 21 гена в 190 образцах ткани молочной железы, из них 57 образцов рака молочной железы (РМЖ), 38 образцов фиброаденомы (ФА) молочной железы и 95 образцов морфологически неизмененной ткани. Средний возраст больных ФА составил 33,1±10,6 лет, средний размер опухоли 3,2±2,9 см3. В 65% опухоль локализовалась в верхне-наружном квадранте молочной железы.

Средний возраст больных РМЖ составил 57,1±11 лет. В 63,1% (36 из 57 случаев) гистологически опухоль была представлена инфильтративным протоковым раком, в 19,2% (11 из 57) – инфильтративным дольковым, в 8,7% (10 из 57) наблюдались прочие формы (муцинозный рак и др.). В 75,3% (43 из 57 случаев) размер опухоли не превышал 5 см, в 10,5% (11 из 57) наблюдалось распространение опухоли на кожу молочной железы, грудную стенку, инфильтративные отечные формы (Т4). Регионарные метастазы (N1 – N3) наблюдались в 46,6% (26 из 57 случаев), отдаленные (на момент операции) в 7,1% (4 из 57). Опухоли I, II и III степени злокачественности встречались в 14% (8 из 57), 56,1% (32 из 57) и 29,9% (17 из 57), соответственно. Экспрессия рецепторов эстрогена наблюдалась в 66,7% (38 из 57), прогестерона в 63,2% (36 из 57), гиперэкспрессия HER2/neu (3+) в 14% (8 из 57), амплификация c-erbB2 в 29,2% (9 из 32 случаев).





Все пациентки проходили обследование и получали лечение в хирургических отделениях ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития в период с ноября 2009 по июль 2011 года. Гистологические заключения давались в соответствии с гистологической классификацией опухолей молочной железы (ВОЗ, 2003г.) (F.A. Tavassoli, P. Devilee ”Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs”. - IARC, Lyon.- 2003: 432). Оценка степени злокачественности рака молочной железы давалась в соответствие с критериями Elston-Ellis (Elston C.W., Ellis I.O. “Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up.”- Histopathology.- 1991. - v.19.- №5.- р.403–410.).

Для иммуногистохимического (ИГХ) определения экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона использовались антитела (NCL-L-ER-6F11, NCL-L-PGR-312, Leica, Великобритания). Для ИГХ определения экспрессии онкобелка C-erbB2 использованы моноклональные мышиные антитела NCL-L-CB11 производства фирмы Leica, Великобритания. Результаты иммуногистохимических реакций экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона оценивались полуколичественным способом (Allred D.C., et al., 1998). Оценка экспрессии онкобелка C-erbB2 выполнялась согласно рекомендациям A. C. Wolff и соавт. 2007.

Анализ уровня экспрессии генов проводился на основании количественного измерения мРНК методом ПЦР с обратной транскрипцией. Для каждого образца анализировалась экспрессия 21 гена (17 функциональных генов и 5 референсных). Для удобства интерпретации результатов функциональные гены были объединены в 5 групп: гены -маркеры пролиферации (KI67, STK15, CCNB1) и ингибитор пролиферации PTEN, гены ингибиторы апоптоза (BIRC5, BCL2, BAG1, TERT) и активаторы апоптоза(BAX, NDRG1), гены клеточной дифференцировки: рецептор эстрогена ESR, рецептор прогестерона PGR, рецептор эпидермального фактора роста C-erbB2 и его гомолог GRB7, а также маммаглобин MGB1, и гены межклеточных взаимодействий (MMP11, CTSL2). В качестве референсных использовали гены GUSB, B2M, ABL, HPRT и TBP.

Забор исследуемого материала для молекулярно-генетического анализа проводился сразу после операции по поводу рака молочной железы или фиброаденомы. После получения ткани она немедленно помещалась в стабилизирующий раствор (EverFresh RNA, «Клоноген», Россия) и хранилась при -70оС. В каждом случае одновременно производился забор морфологически неизмененной ткани молочной железы. Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов реагентов для выделения РНК RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, USA). Реакции обратной транскрипции и ПЦР ставили, используя наборы и оборудование НПО «ДНК Технология» согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных циклов (Cp).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического и параметрического анализа. Различие групп полагали статистически значимым при Р<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете Statistica 6.0 (StatSoft, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительная оценка экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани, фиброаденомы и рака молочной железы.

I. Анализ изменения экспрессии генов в зависимости от типа ткани.

    1. Сравнение морфологически неизмененной ткани (МНТ) и ткани рака молочной железы (РМЖ)

При сравнительном анализе экспрессии 17 генов в морфологически неизмененной ткани и образцах инвазивного РМЖ был выявлен ряд достоверных отличий. В таблице 1 представлены значения экспрессии генов, для которых отличия статистически значимы.

Таблица 1. Уровни экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани (МНТ) и при раке молочной железы (РМЖ). Статистически значимые отличия отмечены *.

Ген

n - МНТ

n - РМЖ

Среднее - МНТ

Среднее - РМЖ

p

KI 67

57

57

16,24

115,34

0,000001*

STK15

57

57

52,29

230,16

0,000011*

CCNB1

57

57

11,03

54,45

0,000004*

PTEN

57

57

10,95

7,31

0,000314*



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.