WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Качественная оценка молекулярно-биологических факторов раннего канцерогенеза шейки матки (

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ХУНОВА Лилия Заудиновна

КАЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

РАННЕГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА ШЕЙКИ МАТКИ

(14.01.12 – онкология)

http://rncrr.ru

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2011

Работа выполнена в ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России

(директор - член-корр. РАМН, профессор Солодкий В.А.)

Научные руководители: член-корр. РАМН, профессор

Ашрафян Левон Андреевич

доктор медицинских наук,

профессор Боженко Владимир

Константинович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Рожкова Надежда Ивановна

доктор медицинских наук,

Подистов Юрий Игоревич

Ведущая организация: ФБГУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России (249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4)

Защита состоится « 23 » января 2012 г в 13.00 часов, на заседа­нии диссертационного совета Д 208.081.01при ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России (117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России (117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86)

Автореферат разослан « » декабря 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

д.м.н., профессор З.С. Цаллагова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Рак шейки матки (РШМ) в настоящее время в России является третьим по частоте злокачественным процессом женских половых органов и встречается с частотой примерно 12,2% на 100. тыс. населения (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008).

Значительным достижением в борьбе за снижение заболеваемости раком шейки матки явилась разработка и внедрение в практическое здравоохранение методов цитологического скрининга, в тоже время активно развиваются разработки молекулярно-биологических методов диагностики и скрининга РШМ.

Одним из основных направлений вторичной профилактики рака шейки матки является своевременная диагностика и лечение предопухолевых состояний. Согласно международной классификации основной патологией, предшествующей раку шейки матки, является дисплазия или цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN), которая подразделяется на 3 степени: легкая, средняя и тяжелая (или прединвазивная карцинома). Согласно эпидемиологическим данным, лишь 15% цервикальных интраэпителиальных неоплазий III степени (CIN III) прогрессирует в инвазивную карциному. При более легких вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий этот процент еще ниже.

Учитывая эти данные, вполне закономерной становится проблема разработки методов прогноза развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий. В соответствии с современными представлениями начальные этапы канцерогенеза РШМ представляют собой каскад определенных молекулярно-генетических изменений. При этом изменяется функциональность таких основных клеточных процессов, как пролиферация клетки, апоптоз, межклеточное взаимодействие. Углубленный анализ этих изменений позволяетт расширить спектр методов уточняющей диагностики преодопухолевых и опухолевых процессов шейки матки (Семиглазов В.Ф. и др., 2008). Возможность проспективного прогнозирования за последние годы показана при исследовании тканевых молекулярно-биологических маркеров для таких сложных событий, как рецидив опухоли в период до 10 лет.

Ключевыми регуляторами апоптоза являются семейства белков BCL2, BAX,BAG. Белок, кодируемый геном BCL-2, является белком-супрессором апоптоза. Выключение BCL-2 приводит к массивному р53 зависимому апоптозу. В настоящее время большое внимание уделяется оценке экспрессии мРНК BCL-2 в эпителии шейки матки как потенциального маркера значимых этапов в патогенезе цервикальных интраэпителиальных неоплазий (Koskimaa H.M. и др. 2010). Семейство генов BAG - группа мультифункциональных генов, взаимодеймтвующих с шаперонами (Hsp70) и ингибирующих их. Одна из функций BAG – связывание с BCL2, что приводит к подавлению апоптоза.

Процесс пролиферации контролируется большим количеством генов. В тоже время найден ряд ключевых маркеров пролиферации, одним из таких универсальных маркеров пролиферации считается белок, кодируемый геном Ki-67. Он экспрессируется в течении всех фаз клеточного цикла делящейся клетки. В литературе отмечается, что цервикальные интраэпителиальные неоплазии характеризуются его повышенной экспрессией (Saha B. и др. 2007). Другой важный маркер пролиферации – ген CCNB1 (Циклин В), контролирующий прохождение клетками М-фазы клеточного цикла. Ряд исследователей обнаружили его гиперэкспрессию при раке шейки матки. Кроме того, ключевым фактором неограниченной пролиферации принято считать активацию в опухолевых клетках фермента теломеразы. Показано, что около 85% опухолей человека обладают теломеразной активностью, однако количественные закономерности экспрессии данного фермента при различных стадиях неоплазии изучены недостаточно. (Егоров Е.Е. 2001г., Griffith J.D. 1999г.).



Необходимо также сказать, что в подавляющем большинстве случаев, канцерогенез в шейке матки происходит на фоне вирусной инфекции. Наиболее часто встречается вирус папилломы человека (ВПЧ). В настоящее время принято считать, что продукты экспрессии вирусного генома – белки E7, E6 непосредственнo участвуют в канцерогенезе. Однако соотношение уровней экспрессии вирусных белков и белков – регуляторов пролиферации и апоптоза изучено недостаточно. В связи с выше сказанным нами были сформулированы следующие цель и задачи.

Цель работы. Исследовать соотношение процессов пролиферации и апоптоза и сформировать спектр основных факторов, отражающих процессы начального канцерогенеза в клетках эпителия шейки матки.

Задачи исследования:

  1. Изучить уровень экспрессии белка Е7 при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля.
  2. Изучить степень теломеразной активности при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля.
  3. Изучить уровень экспрессии молекулярных маркеров пролиферации (Ki67, CCNB1) и апаптоза (BCL2, BAX, BAG) при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля.
  4. Определить молекулярно-биологические критерии раннего канцерогенеза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях.

Научная новизна.

Изучены варианты экспрессии онкобелка Е7.

Определен уровень теломеразной активности при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки.

Впервые проведен сравнительный анализ уровня экспрессии генов пролиферации (Ki67, CCNB1) и генов апаптоза (BCL2, BAX, BAG) при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки.

Впервые обнаружено отличие экспрессии основных молекулярных маркеров пролиферации и апоптоза в группах, содержащих и не содержащих вирус ВПЧ.

Определены молекулярные критерии начальных этапов кацерогенеза РШМ.

Практическая значимость. Обнаруженные в работе молекулярные маркеры раннего канцерогенеза могут быть положены в основу метода дифференциальной диагностики интраэпителиальных неоплазий. Полученные молекулярно-генетические данные могут войти в комплекс прогностических маркеров, отражающих возможные пути развития гиперпролиферативных заболеваний шейки матки, что позволит сформировать дифференцированный подход и лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий, широко используя консервативные методы терапии, и улучшить качество медицинской помощи при патологии шейки матки.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Большинство наблюдений цервикальных интраэпителиальных неоплазий III ст. (cr in situ) и инвазивный рак шейки матки сопровождаются экспрессией онкобелка Е7 в сочетании с ВПЧ высокого онкологического риска.
  2. Высокий уровень теломеразной активности выявляется при СIN III и ивазивном раке шейки матки.
  3. При цервикальных интраэпителиальных неоплазиях увеличивается экспрессия генов, контролирующих пролиферацию и уменьшение экспрессии генов, контролирующих апоптоз.
  4. Лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий в группе пациенток раннего репродуктивного возраста должно сопровождаться и опираться на результаты молекулярно-биологических методов

Апробация работы.

Основные результаты работы представлены и доложены на Всероссийском научном форуме «Радиология 2005», (Москва, Центр международной торговли 31мая-3 июня 2005г.) Российский Форум «Мать и дитя», «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» ( Москва, 4-9 июня 2007г. ) Международный конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (ФГУ РНЦ РР Москва 2007г.), Международный конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (ФГУ РНЦ РР Москва 2008г.). 13th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society which will be held in Prague, Czech Republic. 2010.

Материалы диссертации доложены на VIII конгрессе «Человек и лекарство» 11-15 апреля 2011г.

Апробация диссертации состоялась 18 июля 2011 года на научно- практической конференции ФГУ «РНЦ РР» Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 290 источника, из них 84 отечественных и 116 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика пациентов и методов исследования

Исследование основано на клинико-морфологическом и молекулярно-биологическом обследовании 76 пациенток, из которых: 16 пациенток с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки, средний возраст лет 41,1±9,6 лет, 40 пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени (CIN 1, CIN2, CIN 3 (плоскоклеточный рак in situ)) средний возраст 37,5±10,5 лет, находившихся на лечении в ФГБУ РНЦРР в период с 2006-2010 год. Контрольную группу составили 20 женщин с морфологически неизмененным эпителием шейки матки, средний возраст составил 38±12,4.





Диагностика цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки основывалась на комплексном клиническом обследовании, результатах расширенной кольпоскопии (электроконизация шейки матки, аппарат «Сургитрон»), цитологического и гистологического исследования в соответствии с отраслевыми стандартами объемов обследования и лечения в гинекологии (Кулаков В.И. и соавт.,1999) и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии (Сухих Г.Т., Солодкий В.А., Ашрафян Л.А., Рожкова Н.И. 2011). Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) и рака шейки матки. Стадирование эпителиальных дисплазий проводилась в соответствии с МКБ-X (1995), ГКО женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в соответствии с классификацией TNM и FIGO (1997).

Цитологическое исследование цервикальных мазков и гистологическое исследование биоптатов шейки матки и операционного материала (шейка матки, регионарные лиматические узлы) выполняли по стандартной методике цитологического (Меркулов Г. А., 1969; Лилли Р., 1969) и гистологического (Хмельницкий О.К., 1994, 1999; Автандилов Г.Г., 2002; Семченко В.В., 2003) методов исследования.

Детекция ВПЧ проводилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по стандартной методике (К.Муллис 1983г.).

Для оценки экспрессия мРНК генов Ki67, BAG,ССNB1, BCL2 использован материал соскобов и биопсий шейки матки. Для ПЦР-исследований забор материала соскобов цервикального канала и поражений шейки матки осуществлялся одноразовыми зондами до проведения комплексного обследования и начала лечения заболеваний шейки матки в пробирки со средой для стабилизации РНК. Хранение материала до начала исследования осуществляли при -70°С.

Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы “Проба НК” (ДНК-Технология, Россия). Реакцию обратной транскрипции ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). Для обратной транскрипции использовались коммерческие реактивы (ДНК-Технология, Россия). Реакцию проводили при температуре 40 С в течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95С в течение 5 минут.

Исследование количества к-ДНК проводили в режиме “реального времени” в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80С 30 сек, 94С 1 мин 30 сек; 50 циклов - 94С 20 сек, 64С 20 сек; 10С - хранение 94С на приборе “ДТ-964”. ДНК-зонды, использовавшиеся для детекции продуктов амплификации исследуемых и референсных генов, были помечены FAM. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен “горячий старт”, который обеспечивался использованием парафина. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64С. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.

Нормировка проводилась по пяти референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB, ABL. Обработка результатов осуществлялась с помощью программы EXСEL на основании данных, полученных с помощью прибора. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод Cq).

Статистическая обработка исследуемых переменных выявила, что распределение значений не может быть аппроксимировано нормальной функцией распределения, поэтому для оценки достоверности отличия средних значений в группах на равнее с критерием Стьюдента использовались непараметрические методы: ранговый тест Краскелла-Уолллиса, медианный тест.

Данные обрабатывались при помощи пакета статистических программ «STATISTICA-6», разработанного фирмой Statsoft (USA). При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Папилломавирусная инфекция и онкобелок Е7 у больных раком шейки матки.

С целью определения наличия вирусов в зависимости от стадии заболевания (местной распространенности процесса) и детекции при этом онкобелка Е7. В таблице 1 представлены частоты обнаружения ВПЧ при различной патологии шейки матки.

Табл. 1.Частота определения ВПЧ (абс. число/%) в образцах опухолевой и нормальной ткани шейки матки.

Группа

исследования

N

ВПЧ-позитивные образцы

ВПЧ-негативные образцы

CINI

17

13 (78,1%)

4 (21,9%)

CINII

11

8 (69,7%)

3 (30,3%)

CINIII (cr in situ)

12

10 (91%)

2 (9%)

Инвазивный РШМ

16

13(83,8%)

3 (16,2%)

Контрольная агуппа

20

9 (49%)

11 (51%)



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.