WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга apostichopus japonicus

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БОГАТЫРЕНКО ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕТЕРОТРОФОВ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА КИШЕЧНИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ТРЕПАНГА APOSTICHOPUS JAPONICUS

03.02.08 – экология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток, 2013

Работа выполнена на кафедре экологии Школы естественных наук Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Бузолева Любовь Степановна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член – корреспондент РАЕ, зав. кафедрой анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы, профессор ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Чхенкели Вера Александровна кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН Белькова Наталья Леонидовна
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО "Дальрыбвтуз"

Защита диссертации состоится 30 мая 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГУ по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Бульвар Гагарина, 24.

Отзывы просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, биолого-почвенный факультет ИГУ. Тел. / факс: (3952) 241855; e-mail: dissovet07@gmail.com.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук,

доцент А.А. Приставка

Актуальность работы. Дальневосточный трепанг Apostichopus japonicus относится к важным объектам промысла в морях Дальнего Востока, являясь одним из самых дорогих и востребованных на международном рынке морепродуктов. Несмотря на то, что у побережья Китая обитает около 20 видов голотурий, в том числе и таких коммерчески важных, как Thelenota ananas, Actinopyga miliaris, Holothuria nobilis, наиболее высоко ценится продукт, получаемый именно из дальневосточного трепанга, поэтому он пользуется повышенным спросом в Китае, Корее, Японии. Ткани гидробионта содержат богатый набор биологически активных химических соединений, что обуславливает высокую фармакологическую ценность получаемых из трепанга продуктов (Левин, 2000). Пищевая и целебная ценность голотурии привела к интенсификации промысла и несоблюдению норм вылова, а с начала 90-х годов прошлого столетия, и к массовому браконьерскому вылову дальневосточного трепанга, что, в конечном счете, сказалось на значительном сокращении численности популяций этого животного во всех районах его обитания. При наметившейся тенденции уменьшения запасов данного биоресурса вполне очевидно, что за счет естественного воспроизводства численность беспозвоночного восстановиться не сможет, что в итоге приведет к исчезновению вида Apostichopus japonicus (Сергеенко, Дубровский, 1994).

На сегодняшний день одним из способов восстановления численности популяции дальневосточного трепанга является марикультура. В Приморском крае России уже существуют десятки акваферм, занимающихся искусственным разведением голотурии. Одной из ключевых проблем подобных морских хозяйств является высокая смертность трепанга на ранних стадиях его развития, что, по мнению некоторых ученых, связано со снижением иммунитета гидробионта и его подверженности различным инфекционным заболеваниям из-за постоянно действующих факторов стресса: высоких нагрузок биомассы на единицу объёма, органических загрязнений воды, перепадов концентрации кислорода (Захарова, Шатковская, 2008). Тем не менее, в литературе отсутствуют данные о влиянии искусственных условий воспроизводства на изменение состава и численности бактериальных сообществ кишечной микрофлоры трепанга, также как и отсутствуют данные о составе нормальной кишечной микрофлоры этого гидробионта. Известно, что дальневосточный трепанг по способу питания является детритофагом-грунтоедом, и в среднем за год через его кишечник проходит огромное количество грунта вместе с различными микроорганизмами и останками морских растений и животных (Левин, 1982). Таким образом, становится очевидным огромное значение собственной микрофлоры трепанга в переработке и усвоении попадающей с пищей органики.

Как показывает зарубежный и отечественный опыт, одним из наиболее перспективных способов снижения смертности промысловых видов рыб, моллюсков и ракообразных при их искусственном разведении является использование препаратов на основе пробиотиков, которые представляют собой живые организмы и (или) вещества микробного или иного происхождения, повышающие активность иммунной системы, принимающие активное участие в процессах пищеварения, способствующие восстановлению естественной микрофлоры (Бурлаченко и др., 2006). В настоящее время известно несколько механизмов положительного воздействия пробиотиков на организм, одним из которых является синтез пищеварительных ферментов, улучшающих деятельность желудочно-кишечного тракта (Verschuere et al., 2000).



На сегодняшний день в литературе наиболее полно описаны эколого-географические аспекты использования ресурсов Apostichopus japonicus для сохранения и восстановления его численности (Лебедев, 2002). Что же касается изучения микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга, то информация по данному вопросу практически отсутствует. В работе Шульгиной Л.В. (1982) приведены данные только о сезонной динамике численности бактерий в пищеварительном тракте голотурии, детрите и морской воде из мест обитания животного. О ферментативной активности выделенных из дальневосточного трепанга микроорганизмов упоминается лишь в некоторых работах, целью которых был поиск источников биологически активных ферментов (Урванцева и др., 2006; Беленева и др., 2010; Hirimuthugoda et al., 2007).

Цель данной работы - изучить качественный, количественный состав и биохимические свойства бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга из естественной среды обитания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из кишечников трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.
  2. Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из грунтов с мест обитания трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.
  3. Изучить активность пищеварительных ферментов бактерий, выделенных из кишечника трепанга.

Научная новизна работы. Впервые изучены видовой состав и численность культивируемых бактерий, входящих в состав кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга. Установлено, что бактериальное сообщество кишечника трепанга формируется за счет микробиоты грунта из мест обитания голотурии.

Впервые представлена качественная и количественная характеристика амилолитической, хондроитинсульфатазной, хитинолитической, альгинатлиазной, липолитической и протеолитической активности кишечной микрофлоры трепанга.

Практическая значимость работы. Впервые получена коллекция штаммов бактерий, населяющих кишечник дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus. Полученные микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью, что делает их весьма ценными для использования в биотехнологии. Кроме того, ряд выделенных штаммов с высокими значениями активности пищеварительных ферментов, рекомендован для применения в качестве пробиотиков при искусственном разведении голотурий. Фрагменты работы используются в качестве материалов для лекций учебной дисциплины «Морская микробиология» и летней практики студентов Дальневосточного федерального университета.

Защищаемые положения:

  1. Видовой состав бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга специфичен, так как формируется за счет только факультативно анаэробных бактерий, населяющих грунты в местах обитаний голотурии.
  2. Бактерии кишечной микрофлоры трепанга характеризуются высокой активностью пищеварительных ферментов как потенциальные пробиотики для использования в марикультуре.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии», г. Владивосток, 2009; IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии», г. Владивосток, 2010; I Дальневосточной междисциплинарной молодежной научной конференции «Современные методы научных исследований», г. Владивосток, 2011;
3-ем Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах», г. Иркутск, 2011; XIII международной научно-практической конференции "Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности и экономике", Санкт-Петербург, 2012. Результаты исследований были представлены на VI Межрегиональной экологической научно-практической конференции «Экологические аспекты региона», г. Воронеж, 2010; Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию со дня рождения И.И. Месяцева, г. Мурманск, 2010; I Международной научно-практической конференции «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий», Чебоксары, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения; обзора литературы, посвященного актуальности искусственного воспроизводства дальневосточного трепанга, проблемам, связанным с его культивированием, а также международному опыту успешного применения пробиотиков в марикультуре; главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов; двух экспериментальных глав, посвященных изучению бактериального состава микрофлоры кишечника трепанга, а также характеристике активности пищеварительных ферментов, полученных из него штаммов бактерий; выводов; списка литературы, который включает 147 источника, в том числе 83 иностранных, и 19 приложений.





Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, 9 таблицами и 19 приложениями. Данная работа выполнена при финансовой поддержке фондов Министерства образования и науки по проектам: 1.2.09; АВЦП 2.1.1./4793; Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, дог. № 11.G34.31.0010

Благодарности. Автор искренне благодарит своего научного руководителя Бузолеву Любовь Степановну, д.б.н., профессора за всестороннюю помощь, поддержку и за помощь в освоении экспериментальных методов, а также ценные консультации на всех этапах работы. Особую благодарность автор выражает профессору Чши Чжемину, заведующему лаборатории морских микроорганизмов Океанологического университета г. Циндао (Китая), а также всем сотрудникам указанной лаборатории за помощь в проведении экспериментов и постоянный интерес к работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе описаны морфология, биология, экология дальневосточного трепанга, подчеркнута актуальность проблемы сокращения численности природной популяции животного за счет браконьерства, а так же рассмотрены особенности и проблемы культивирования трепанга в искусственных условиях. Изучены различные классификации пробиотиков, показаны механизмы их положительного воздействия на организм хозяина. Проанализирован опыт успешного применения пробиотиков при искусственном разведении гидробионтов.

Глава 2. Материалы и методы

Выделение и идентификация микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания. Для проведения исследований по изучению свойств микрофлоры дальневосточного трепанга (Apostichopus japonicus) в августе 2004 и 2006 г.г. на глубине 5-10 м было собрано 10 взрослых особей голотурии (по 5 из каждого района) из б. Алексеева и б. Киевка Японского моря (Приморский край России). Одновременно с этим, в указанных районах были отобраны пробы грунта в местах обитания трепангов. В условиях стерильности кишечники трепангов были извлечены с помощью скальпеля и гомогенизированы. Гомогенат тканей и суспензию грунта после серийных разведений высевали на агаризованную питательную среду СММ (среда для морских микроорганизмов) и культивировали в термостате при температуре 25C в течение двух суток (Youchimizu, Kimura, 1976). После этого различные по морфологии одиночные колонии подсчитывали, а затем откалывали с помощью микробиологической петли и пересевали на чашки с той же средой для получения чистых культур. Численность микроорганизмов выражали в КОЕ/г массы сухого гомогената ткани кишечника или грунта.

Идентификацию полученных штаммов бактерий проводили на основе морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств. Отдельно выбранные штаммы были идентифицированы с помощью готовых биохимических API - тестов производства компании bioMerieux (Франция). Для подтверждения таксономического статуса некоторые штаммы идентифицировали с применением анализа последовательностей 16S рРНК генов.

Дальнейшая работа по изучению ферментативной активности микроорганизмов проводилась путём посева штаммов на плотные и жидкие среды с хитином, крахмалом, хондроитинсульфатом, альгинатом натрия, твинами 40 и 80, оливковым маслом, казеином и желатином.

Определение активности амилаз и хондроитинсульфатаз. Для качественного определения амилолитической и хондроитинсульфатазной активности исследуемые штаммы были высеяны на чашки с агаризованными минерально-солевыми средами, содержащими крахмал и хондроитинсульфат соответственно. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре 25С трое суток, после чего в чашки с крахмальной средой добавляли раствор Люголя и отмечали появление светлых колец вокруг колоний, свидетельствующее о наличии амилаз, а на среде с хондроитинсульфатом фиксировали образование зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий. Для количественной оценки продуктивности ферментов из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили взвеси, которые вносили в жидкую СММ, и выращивали на качалке при 25С в течение двух суток. Активности ферментов измеряли по методу Шомодьи (Somogyi, 1952).

Определение хитинолитической активности. Хитиназную активность учитывали в динамике (через 2, 4, 7 и 9 дней) по зонам просветления вокруг посева на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота коллоидный хитин. Для дальнейшего изучения свойств бактерий, проявивших активность на плотной среде, приготовленные из суточных культур бактериальные взвеси вносили в жидкую питательную среду, содержащую нативный хитин (10 г/л), и выращивали на качалке при 25С в течение 9 суток (Слабоспицкая, Крымовская, 1992). Хитинолитическую активность определяли в динамике через 2, 4, 7 и 9 суток, используя модифицированный колориметрический метод оценки количества
N-ацетиламиносахаров (Reissing et al., 1955).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.