WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Ботина Светлана Геннадиевна

Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

03.02.03 - микробиология

03.01.06 - биотехнология

Автореферат диссертации

на соискание степени

доктора биологических наук

Москва

2011

Работа выполнена в Центральной лаборатории микробиологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии

Научный консультант:

Доктор технических наук, профессор Семенихина Вера Филатовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич

Доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич

Доктор медицинских наук, профессор Суворов Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Оболенск.

Защита состоится «__»________ 2011 года в___ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «____» ____________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к созданию и отбору новых микроорганизмов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленные на получение продуктов питания и пробиотических препаратов нового поколения, заложены в трудах российских и зарубежных ученых (Семенихиной В.Ф., 2007; Ганиной В.И., 2005; Рогова И.А., 2006; Шевелевой С.А., 2005; Шендерова Б.А., 2005; Алешкина В.А., 2003; Алешкина А.В., 2010; Амерхановой А.М., 2009; Бондаренко В.М., 2007; Bover-Cid S., 2003; De Vuyst L., 2008; Eerola S., 2006; Klaenhammer T.R., 2008; Leroy F., 2008; Madsen S.M., 2004; Niinivaara F., 2005; Tanous C., 2003; Vandamme E.J., 2004 и др.)

Исследования и фундаментальные достижения последних десятилетий в микробиологии, генетике и молекулярной биологии дали возможность изучения генетического разнообразия бактериальных штаммов. С развитием генетической систематики, с расширением круга используемых методов, направленных на изучение бактериального генома и накоплением экспериментальных данных, касающихся генетического разнообразия различных таксономических групп бактерий, современная таксономия бактерий стала быстро развиваться, что позволило решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов (Турова Т.П., 2009). Вместе с тем оставались нерешенными проблемы, связанные с противоречиями между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа в отношении группы молочнокислых бактерий имеющих практическое применение.

До недавнего времени при отборе штаммов для создания бактериальных заквасок использовались только стандартные микробиологические подходы оценки стартерных культур, такие как выделение, идентификация таксономического положения на основе изучения их морфологических, физиолого-биохимических свойств, определение условий культивирования и их технологических свойств. Однако использование только этих традиционных технологий не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы молочнокислых бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Многими исследователями отмечалось, что у микробиологов возникают трудности при идентификации на видовом и дифференциации на внутривидовом уровне бактерий различных родов факультативных анаэробов. Особенно трудно идентифицировать виды внутри родов: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus с помощью классических фенотипических методов (Dellaglio F., 1999; Giraffa G., 2002; Andrighetto C., 2004; Neviani E., 2003; Stackebrandt E., 2002; Facklam R., 1989; Eaton T.J., 1999; Gasson M.J., 2005; Стоянова Л.Г., 2006, Машенцева Н.Г., 2008). В этой связи особую актуальность приобретает проблема использования современных фундаментальных научных достижений изучения бактериального генетического разнообразия в прикладных областях науки. Фенотипическая характеристика штамма, применяемая для идентификации, паспортизации и типирования штаммов бактерий в настоящее время уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма и целостной характеристики его свойств. Что же касается штаммов молочнокислых бактерий, практически использующихся в пищевой промышленности, использование современных молекулярно-биологических подходов для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит выбирать лучшие стартовые культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных пищевых продуктов и бактериальных препаратов.



Цель работы - применение комплекса молекулярно-биологических методов для изучения генетического разнообразия штаммов молочнокислых бактерий и использование результатов этого исследования при отборе бактериальных культур для создания заквасок, позволяющих гарантировать производство качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Задачи исследования

1. Выделить природные штаммы молочнокислых бактерий из естественной среды обитания (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека).

2. Показать необходимость использования молекулярно-биологических методов при установлении видовой принадлежности молочнокислых бактерий. Применить метод анализа последовательности гена 16S рРНК для идентификации бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

3. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов Streptococcus thermophilus с использованием методов геномной рестрикции и PFGE.

4. Продемонстрировать возможность использования метода анализа данных о последовательности гена 16S рРНК для внутривидовой дифференциации подвидов L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis. Применить этот метод для идентификации бактериоцинпродуцирующих штаммов L. lactis.

5. Изучить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации молочнокислых бактерий и осуществить генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий Streptococcus и Lactobacillus с использованием этого метода.

6. Продемонстрировать необходимость проведения исследований с использованием молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применить метод ПЦР-генотипирования штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса.

7. Протестировать штаммы Streptococcus thermophilus на наличие технологичных и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) и отобрать среди них наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов при производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения.

Научная новизна работы

Впервые проведено выделение и изучение новых штаммов молочнокислых бактерий из различных экологических ниш (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека: гастроинтестинальный тракт, ротовая полость и грудное молоко кормящих женщин) и разных географических регионов (Россия, страны Восточной и Западной Европы), на основании этого получены новые фундаментальные знания о физиолого-биохимических и генетических особенностях штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.

Получены новые фундаментальные знания о внутривидовом разнообразии природных изолятов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. При использовании методов геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза (PFGE) и сравнительного анализа подобия геномных фингерпринтов продемонстрированы доказательства вариабельности изученных штаммов по размерам их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов сильно варьирует – от 1417 до 2075 т.п.н., т.е. различия между минимальным и максимальным значением размера генома составляет около 600 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.

Впервые выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов бактерий рода Enterococcus, что послужило основой классифицировать организмы, имеющие существенное отличие в нуклеотидных последовательностях генов rrs, как новый вид - Enterococcus lactis (нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК типового штамма нового вида Enterococcus lactis СК1114 депонирована в базе данных NCBI (номер депонированной последовательности AY902459). Штамм депонирован в коллекции ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (номер депонированного штамма В8713).

Впервые продемонстрировано существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у штаммов подвида Lactococcus lactis subsp. cremoris, дающее возможность проводить точную молекулярную таксономическую идентификацию культур L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis, трудно дифференцируемых с использованием классических микробиологических подходов.

Теоретическая значимость работы

Теоретически обоснована необходимость использования молекулярно-биологических подходов для отбора бактериальных стартерных культур при создании заквасок для биотехнологии, позволяющих гарантировать выпуск качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.





Полученные новые данные о таксономическом, генетическом разнообразии и биохимических, технологических, пробиотических и генетических свойствах штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus расширяют границы фундаментальных знаний о бактериях этих систематических групп и возможностях их использования в различных биотехнологических процессах.

Практическое значение работы

Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий родов Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, дало возможность целенаправленно проводить отбор штаммов, перспективных для использования в биотехнологии, учитывая их генетические характеристики.

Проведена реклассификация (с применением методов молекулярно-генетической идентификации) некоторых производственных культур рода Lactobacillus, применяемых в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.

Показана необходимость проведения исследований с помощью молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Примененное ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса, служит основанием исключения из состава заквасок культур, которые могут быть источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.

Проведенная паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики RAPD-PCR и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от несанкционированного использования штаммов, авторами которых они являются, в аналогичных биотехнологических процессах недобросовестными производителями.

Полученные данные о наличии технологических, производственно - ценных и пробиотических свойств у штаммов Streptococcus thermophilus (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу), могут быть критерием отбора наиболее перспективных культур для применения в качестве заквасок и бактериальных концентратов при изготовления кисломолочных продуктов общего и функционального назначения в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. Штаммы термофильного молочнокислого стрептококка депонированы в коллекцию молочнокислых культур и бифидобактерий ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК некоторых из изучаемых штаммов лактококков, лактобацилл, стрептококков и энтерококков были депонированы в базу данных Nucleotide Sequence Database of National Center for Biotechnology Information (GenBank NCBI) в качестве референтных последовательностей при проведении филогенетических и биоинформатических исследовательских работ ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/?term=Botina ). Номера депонированных последовательностей: DQ255948, AY902459, AY683836, AY902456, AY902457, AY902458, AY902459, AY902460, AY902461, AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, DQ255948, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308,  EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, EF102815, EF102814, EF114309, EF114308,  EF114307, EF114306, EF114305, EF100778, EF100777, GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.

Внедрение результатов работы

Полученные данные о технологических и производственно-ценных свойствах культур термофильных молочнокислых стрептококков послужили основой для оформления патента на изобретение №2337953, Российская Федерация, МПК C12N1/20, A23C9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. «Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты».

На основании теоретических и практических результатов были разработаны «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010.

Современные молекулярно-биологические методики, разработанные в ходе исследования, используются при проведении научных исследований в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные результаты работы нашли применение в лекционных курсах по повышению квалификации для практикующих микробиологов молочного производства «Микробиология молока и молочных продуктов», «Методы и организация производственного контроля» и в обучающем процессе при подготовке аспирантов ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При таксономической идентификации штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученных с помощью применения молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.