WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной х-хромосоме у обыкновенных полевок генетика –

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Дементьева Елена Вячеславовна

СТАТУС ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА НА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЕ У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК

Генетика 03.02.07

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

доктор биологических наук

Лебедев И.Н.

НИИ медицинской генетики СО РАМН,

г. Томск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена, г. Москва

Защита состоится «_28_»__апреля_____2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___»____________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дозовая компенсация генов половых хромосом является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной биологии. Необходимость дозовой компенсации возникает у организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по морфологии и генетическому содержанию. Специализация половых хромосом у самцов млекопитающих приводит к нарушению соотношения уровней экспрессии генов Х-хромосомы между полами, которое устраняется с помощью подавления транскрипции, инактивации, генов на одной из двух Х-хромосом у самок. Процесс инактивации Х-хромосомы изучается уже на протяжении нескольких десятилетий. И хотя в понимании его механизмов достигнут значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.

Гены Х-хромосомы самок млекопитающих в различной степени вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о статусе экспрессии генов Х-хромосомы у человека, мыши и некоторых других видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et al., 2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для Х-хромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов Х-хромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают инактивации, на сегодняшний день не известны.

Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы: импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist. Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist РНК вдоль инактивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций транскрипционно неактивного хроматина (Heard, Disteche, 2006; Шевченко и др., 2006). Было показано, что при случайной инактивации в соматических тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными типами G-бэндов и отличаются по времени репликации в поздней S-фазе (Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). Тем не менее, остается неясным, свойственна ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два типа гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы при импринтированной инактивации.

Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений. Принято считать, что за стабильность случайной инактивации у человека и мыши отвечает метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы. Роль метилирования ДНК в процессе импринтированной инактивации еще только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.



Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus. В данной работе на примере обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной инактивации.

Цель и задачи работы. Цель работы – установление статуса экспрессии генов и модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

  1. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;
  2. Сравнение статуса метилирования промоторных областей и/или первых экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;
  3. Выяснение характера распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в фибробластах, трофобластных стволовых клетках и клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок.

Научная новизна работы. На основе клеточных линий самок межвидовых гибридов M. rossiaemeridionalis M. arvalis создана модельная система для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии 15 генов в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. Проведено сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследован характер распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах при импринтированной инактивации Х-хромосомы.

Положения, выносимые на защиту.

  1. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация Х-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с соматическими тканями;
  2. В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от экстраэмбриональных тканей наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Х-хромосомы и их транскрипционной активностью;
  3. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух типов гетерохроматина, различающихся по составу и локализации.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 – 22 сентября 2006 г.), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа – 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликованы три работы. Одна – в рецензируемом отечественном журнале, две – в рецензируемых зарубежных журналах.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК выполнялась совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом клеточных линий обыкновенных полевок проводился совместно с к.б.н. С.В. Павловой и к.б.н. А.И. Шевченко.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы (182 наименования). Работа изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ

1. Получение и цитогенетическая характеристика линий фибробластов самок гибридов M. rossiaemeridionalis M. arvalis.

Первичные культуры фибробластов легкого гибридной самки M. rossiaemeridionalis M. arvalis получали методом трипсинизации (Nesterova et al., 1994). Препараты метафазных хромосом субклонов готовили согласно (Nesterova et al., 1998). Для выявления позднореплицирующегося хроматина за 6 часов до начала приготовления цитогенетических препаратов метафазных хромосом к клеткам добавляли 5-бромдезоксиуридин. Дальнейшую обработку препаратов и иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к 5-бромдезоксиуридину проводили как описано в работе Shevchenko et al. (2009). РНК-ДНК FISH с зондами на Xist РНК и повтор MS4 из блока гетерохроматина Х-хромосомы M. rossiaemeridionalis был выполнен по стандартным методикам (Lawrence et al. 1989; Fantes et al., 1995). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON X100 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar.





2. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

РНК была выделена из 12,5-дневных эмбрионов самцов и самок M. arvalis и M. rossiaemeridionalis, а также из фибробластов легкого, плацент и субклона линии клеток экстраэмбриональной эндодермы (XEN) гибридных самок M. rossiaemeridionalis M. arvalis с помощью TRI REAGENT (Sigma) или RNAzol B (Biogenesis) согласно инструкциям фирм производителей. Для очистки образцов РНК от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и random decamer праймеров (Invitrogene) согласно прилагаемым рекомендациям. При анализе экспрессии гена Xist в экстраэмбриональных тканях для синтеза кДНК использовался цепь-специфичный праймер SDX3 (5’-cccagtgctggtgagctattcc-3’). Полученная кДНК амплифицировалась с помощью ПЦР. Нуклеотидную последовательность ПЦР-продуктов определяли согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation) на автоматическом секвенаторе в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Поиск межвидовых отличий нуклеотидных последовательностей кДНК осуществлялся программой SeqMan (DNASTAR). Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах, плацентах и клетках XEN самок гибридов M. rossiaemeridionalis M. arvalis определяли методом удлинения праймера на 1 нуклеотид (single nucleotide primer extension, SNuPE) (Singer-Sam et al., 1992). В случае генов Chm, Nap1l3, Rbbp7, Sybl1, Utx в реакции добавлялись [32P]dATP или [32P]dGTP; для генов Atrx, Ddx3x, Hprt, Mid1, Pgk1, Rab9, Sb1.8, Slc7a3, Ube1x, Xist использовались [32P]dCTP или [32P]dTTP.

3. Определение статуса метилирования генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

Геномная ДНК из печени, трофобластных стволовых (ТС) и XEN клеток была выделена как описано в работе Слободянюка с соавт. (1994). Геномная ДНК гидролизировалась EcoRI, а затем чувствительными к метилированию эндонуклеазами рестрикции (New England BioLabs). Саузерн блот-гибридизацию с зондами на промоторную область и/или первый экзон генов проводили согласно руководству Маниатис и др. (1984). Подбор чувствительных к метилированию эндонуклеаз рестрикции осуществляли с помощью программы MapDraw (DNASTAR).

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом.

Цитоцентрифугирование фибробластов, ТС и XEN клеток и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом антителами к различным модификациям хроматина проводилось как описано в работе Shevchenko et al. (2009). Анализ препаратов осуществлялся как при ДНК-РНК FISH. Для каждой модификации хроматина было проанализировано не менее 100 метафазных пластинок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических тканях обыкновенных полевок из легкого гибридной самки M. rossiaemeridionalis M. arvalis была получена первичная культура фибробластов. У гибридных самок M. rossiaemeridionalis M. arvalis инактивация Х-хромосомы происходит неслучайным образом. В 85% клеток неактивной становится Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, остальные клетки содержат неактивную Х-хромосому M. arvalis (Zakian et al., 1987). Чтобы иметь линии фибробластов, где точно известно, Х-хромосома какого вида неактивна, было проведено субклонирование первичной культуры. В результате были получены четыре субклона фибробластов (линии SA004, SA005, SA006, SA007). В работе также использовался ранее полученный в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН субклон фибробластов гибридной самки M. rossiaemeridionalis M. arvalis (линия SAD4). Транскрипционный статус Х-хромосом обоих видов в субклонах оценивался на основании двух свойств неактивной Х-хромосомы: более поздней репликации по сравнению с активным гомологом и экспрессии гена Xist. Было показано, что в субклонах SA004-7 неактивной является Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, а в субклоне SAD4 – Х-хромосома M. arvalis. В качестве экстраэмбриональных тканей использовались плаценты и субклон клеток XEN гибридных самок M. rossiaemeridionalis M. arvalis, в которых импринтированной инактивации подвергается отцовская Х-хромосома M. arvalis (Шевченко и др., 2008).

Для того чтобы различить аллели генов на активной и неактивной Х-хромосоме в клетках гибридных самок, был осуществлен поиск межвидовых различий нуклеотидных последовательностей их кДНК у M. arvalis и M. rossiaemeridionalis. Пары праймеров были подобраны по известным нуклеотидным последовательностям генов обыкновенных полевок или нуклеотидным последовательностям ортологичных генов мыши, крысы и человека. ПЦР-продукты ожидаемых размеров с кДНК M. arvalis и M. rossiaemeridionalis были получены для 26 генов. Секвенирование подтвердило их гомологию исследуемым генам. Межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК были найдены только для 15 генов. В случае остальных 11 генов межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК не были обнаружены, что в дальнейшем не позволило определить их статус экспрессии.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.