WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Эволюция и распространение добавочных (в-) хромосом в азиатских популяциях плавучей кобылки eyprepocnemis plorans charpantier, 1825 (orthoptera, acrididae)

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Дзюбенко Виктория Владимировна

Эволюция и распространение добавочных (В-) хромосом в азиатских популяциях плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans Charpantier, 1825

(Orthoptera, Acrididae)

03.02.07 генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена на кафедре общей биологии и экологии факультета естественных наук ФГОУ ВПО Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бугров А.Г.

Институт систематики и экологии животных

СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор

Кузнецова В.Г.

Зоологический институт РАН,

г. Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Томский государственный университет,

г. Томск

Защита диссертации состоится «___» ____________ ______ г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___» ____________ ______ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В-хромосомы представляют собой дополнение к основному набору хромосом в популяциях многих видов и остаются до сих пор одним из наиболее загадочных элементов генома. К настоящему времени они найдены более чем у 500 видов животных, 1300 видов растений и у 10 видов грибов (см. обзор Camacho, 2005). В-хромосомы, обнаруженные у разных видов, отличаются структурной организацией, происхождением, а также механизмами, поддерживающими их полиморфизм в соответствующих популяциях. Обычно В-хромосомы насыщены повторенными последовательностями ДНК, представленными в виде кластеров или присутствующими в высокой концентрации в определенных районах (Camacho et al., 2000, Camacho, 2005).

Известно более сотни видов саранчовых, в популяциях которых встречаются добавочные хромосомы. Обычно это мелкие хромосомы, состоящие преимущественно из гетерохроматинового материала (Hewitt, 1979; John, 1983; Camacho et al., 2000). Одно из примечательных исключений из этого правила – добавочные хромосомы плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans (Charpantier 1825).

Плавучая кобылка E. plorans – один из наиболее широко распространенных видов саранчовых. Ареал плавучей кобылки охватывает почти всю Африку, Малую Азию, юг Европы, Кавказ и Закавказье, отдельные регионы Центральной Азии (Dirsh, 1958). Вид политипический, включает несколько морфологически слабо различающихся подвидов: E. plorans plorans, E. plorans ibandana, E. plorans meridionalis. В Средиземноморье обитает номинативный подвид Eyprepocnemis plorans plorans (Charp.) (Dirsh, 1958).

При исследовании кариотипов плавучей кобылки E. plorans было выяснено, что хромосомный полиморфизм этого вида связан главным образом с добавочными хромосомами. В западно-средиземноморских популяциях Eyprepocnemis plorans (Испания и Марокко) к настоящему времени выявлено более 65 морфотипов добавочных хромосом (Lopez-Leon et al., 2008), что значительно превышает количество В-хромосом, обнаруженных в генотипе любого другого вида животных. Это позволило использовать плавучую кобылку как уникальную модель для решения вопросов происхождения, эволюции и распространения различных типов свехчисленных хромосом в популяциях животных.

Характерной особенностью доминирующих вариантов В-хромосом в западно-средиземноморских популяциях Eyprepocnemis plorans является чередование С-позитивных и С-негативных районов. Размеры и локализация С-позитивных и С-негативных районов, а также центромерных районов этих хромосом позволили создать классификацию морфотипов В-хромосом и на ее основе строить гипотезы о возможных путях происхождения, эволюции и распространения в популяциях этих добавочных элементов хромосомного набора (Camacho et al., 1980; Henriques-Gil et al., 1984; Lopez-Leon et al., 1993; Bakkali et al., 1999; Camacho et al., 2000).

До настоящего времени восточно-средиземноморские популяции этого вида не были исследованы в цитогенетическом аспекте, за исключением единственной популяции из Северного Кавказа (Дагестан) (Bugrov et al., 1999; Cabrero et al., 2003b). Слабая изученность плавучей кобылки в азиатской части ее ареала не позволяет охарактеризовать общую модель происхождения и эволюции сверхчисленных элементов у модельного вида.

Цель настоящей работы – выявить хромосомный полиморфизм, изучить распространение добавочных (В-) хромосом в азиатских популяциях плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans и определить молекулярно-цитогенетические особенности основного хромосомного набора и добавочных хромосом этого вида.



Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

  1. Изучить кариотипы плавучей кобылки E. plorans из популяций Закавказья, Малой Азии и Южной Африки;
  2. Определить полиморфизм по В-хромосомам в исследуемых популяциях;
  3. Провести молекулярно-цитогенетическое картирование кластеров повторенных последовательностей в А- и В-хромосомах плавучей кобылки методом флуоресцентной гибридизации in situ с 18S рДНК-, 18S-28S-5,8S рДНК-, 180пн сатДНК-пробами и с микродиссекционными ДНК-пробами;
  4. Определить вероятные пути происхождения В-хромосом в популяциях модельного вида в восточной части его ареала;
  5. Предложить адекватную модель, описывающую характер динамических изменений хромосомного полиморфизма и возможных эволюционных преобразований добавочных хромосом в популяциях плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans.

Для выполнения поставленных целей и задач был исследован материал, собранный мной и моим руководителем, Александром Геннадьевичем Бугровым, а также материал, любезно предоставленный нашими коллегами из департамента генетики, возглавляемого профессором Хуан Педро Мартинес Камачо, университета Гранада. Мной был проведен цитогенетический анализ всех полученных образцов, а также флуоресцентная гибридизация in situ с последующим микроскопическим анализом. Микродиссекционные пробы для FISH были приготовлены совместно с Николаем Борисовичем Рубцовым и Татьяной Витальевной Карамышевой (лаборатория Клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН).

Я выражаю огромную благодарность Александру Геннадьевичу Бугрову, Николаю Борисовичу Рубцову, Татьяне Витальевне Карамышевой и Ильясу Еркиновичу Джетыбаеву за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы.

Исследование поддержано Программами «Научные и научно-преподавательские кадры инновационной России» (контракт 02.740.11.0277), «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» (проект № 1557) и «Биоразнообразие и динамика генофондов» (проект № 11.11), грантом Карл Цейс 2008 г. (Carl Zeiss, 2008) и грантом РФФИ № 09-0400401-а.

Научная новизна

Впервые установлено, что хромосомный полиморфизм плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans plorans в восточно-средиземноморской части ареала связан с добавочными (В-) хромосомами и с распределением кластеров повторенных последовательностей (рДНК, 180 пн сатДНК) на А-хромосомах.

В работе описаны восемь новых типов добавочных хромосом. Пять из них преимущественно С-позитивные и два – преимущественно С-негативные без дифференциальной исчерченности, для одного морфотипа характерно чередование С-позитивных и С-негативных блоков. Молекулярно-цитологический анализ показал, что найденные нами В-хромосомы, наиболее вероятно, произошли от одной из пар маленьких аутосом. Молекулярная композиция доминирующих в восточно-средизеноморских популяциях морфотипов добавочных хромосом включает повторенные последовательности, гомологичные ДНК С-позитивных прицентромерных районов А-хромосом, 18S рДНК и С-позитивных районов Ва3-хромосомы. При сравнительном анализе частот доминирующих морфотипов добавочных хромосом в анализируемых популяциях в 2003 и 2007 годах было показано, что полиморфизм по добавочным хромосомам в популяциях из восточной части ареала плавучей кобылки в большей степени соответствует равновесной эгоистической модели динамики добавочных хромосом в популяциях. По всем этим характеристикам полиморфизм по В-хромосомам, сложившийся в популяциях из восточной части ареала плавучей кобылки, отличается от описанного ранее испанскими учеными, что свидетельствует о независимом формировании популяционной структуры вида в исследованных частях ареала плавучей кобылки.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Морфотипы добавочных хромосом из западно- и восточно-средиземноморских популяций модельного вида саранчовых различаются по всем основным характеристикам: по С-дифференциальной окраске, по их молекулярной композиции, по происхождению и дальнейшему поведению в популяциях.

Выявленные отличия свидетельствуют о независимом становлении системы хромосомного полиморфизма в западной и восточной частях ареала E. plorans plorans при историческом расселении популяций вида на новые территории.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты расширяют представления о путях возникновения, распространения и дальнейшей эволюции В-хромосом в популяциях животных.

Выявленный нами эндемичный тип распределения В-хромосом в популяциях плавучей кобылки позволяет использовать этот хромосомный маркёр для реконструкции основных этапов исторического развития самого вида Eyprepocnemis plorans.

Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций по генетике, цитологии и общей энтомологии.

Полученные результаты вносят вклад в общую генетику и в общую энтомологию.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на «Второй конференции по В-хромосомам» (Гранада, Испания, 2004г), на «Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс”» (Новосибирск, Россия, 2004, 2005), на IV и V Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных» (Санкт-Петербург, Россия, 2006; Новосибирск, Россия, 2010), на «VII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока “Энтомологические исследования в Северной Азии”» (Новосибирск, Россия, 2006), на «Отчетной конференции “Программа фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов», подпрограмма «Динамика генофондов»”» (Москва, Россия, 2007, 2008), на «Десятом международном ортоптерологическом конгрессе» (Анталия, Турция, 2009), Отчетной сессии ИСиЭЖ СО РАН (2010).





Публикации

По результатам диссертации опубликовано 13 научных работ.

Из них 4 статьи – в научных журналах, в которых по требованию ВАК Минобрнауки России должны быть опубликованы основные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук по биологическим наукам.

Объем и структура работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 111 страницах, включает 14 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 131 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Сбор насекомых E. plorans осуществляли в частях ареала, где ранее не проводился кариологический анализ особей этого вида.

Был отловлен 381 самец в двух популяциях Армении (130 экземпляров в 2003 году и 251 – в 2007 году), 170 самцов в четырех популяциях Турции (в 2007 году) и 33 самца из одной популяции из Южно-Африканской Республики (в 2007 году). Из каждой популяции было изучено не менее 27 самцов.

В каждой из перечисленных популяций было собрано не менее пяти самок для получения яйцекладок (кубышек).

Нами также был проанализирован материал из испанских популяций, любезно предоставленный нашими коллегами из департамента генетики, возглавляемого профессором Хуан Педро Мартинес Камачо, университета Гранада.

2. Методика фиксации материала

Отловленным самцам в полость тела на 1,5-2,0 ч вводили 0,1-0,2 мл 0,1% раствора колхицина. Затем извлекали семенники, и после гипотонии в 0,9% растворе цитрата натрия их фиксировали в смеси ледяной уксусной кислоты и 96% этанола (1:3). Фиксированный материал отмывали и хранили в 70% этаноле.

3. Методика приготовления хромосомных препаратов из семенников саранчовых

В 70% этаноле отделяли несколько семенных фолликулов. Очищенные семенные фолликулы переносили на чистое предметное стекло (для микродиссекции на покровные стекла 2460 мм), помещали в каплю 60% уксусной кислоты, накрывали покровным стеклом и готовили давленные препараты. Покровное стекло снимали после замораживания препарата на охлажденном жидким азотом столике.

В дальнейшем полученные препараты дифференциально окрашивали для выявления С-позитивных районов, использовали для проведения микродиссекции или флуоресцентной гибридизации in situ (с микродиссекционной пробой, теломерной пробой или с рДНК). Препараты для FISH хранили под вакуумом не менее четырёх дней.

4. Методика приготовления хромосомных препаратов из нейробластов эмбрионов саранчовых

Для получения хромосомных препаратов из нейробластов эмбрионов E. plorans саранчовых нами была использована методика, детально описанная ранее (Bugrov et al., 2001). Яйца с эмбрионами на оптимальной стадии развития (15 – 20-е сутки инкубации при комнатной температуре) помещали в чашку Петри в 0,05 % раствор колхицина на физиологическом растворе для насекомых. После колхицинирования эмбрионы извлекались из яиц и помещали в гипотонический раствор. После гипотонии эмбрионы фиксировали в смеси ледяной уксусной кислоты и 96 % этанола (1:3). Препараты из фиксированных эмбрионов готовили методом клеточной суспензии на предметном стекле. Препараты из эмбрионов окрашивали тем же способом, что и давленые препараты из семенников самцов.

5. Методика дифференциальной окраски красителем Гимза для выявления С-позитивных районов

Для выявления С-позивных районов хромосом использовали методики Самнера (Sumner, 1972) и Джонса с соавт. (Jones et al., 1975) с некоторыми модификациями.

6. Методика выявления активных ядрышкообразующих районов (ЯОР)

Наиболее подходящей методикой для выявления активных ядрышкообразующих районов у саранчовых оказалась методика, предложенная для хромосом листоблошек (Psillidae) (Goodpasture, Bloom, 1975; Maryanska-Nadachowska et al., 1992).

Для окрашивания использовали два раствора. Первый раствор – раствор желатина с добавление концентрированной муравьиной кислоты. Второй – представлял собой водный раствор AgNО3. На сухие давленые препараты наносили первый и второй растворы из соотношения 1:2, после инкубации во влажной камере препараты промывали водой и высушивали на воздухе.

8. Микродиссекция метафазных хромосом

Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером, в стерильных условиях специально приготовленными для этого микродиссекционными иглами согласно протоколу, описанному Н.Б. Рубцовым (Rubtsov et al., 2000).

9. Флуоресцентная гибридизация in situ

Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили, в соответствии с протоколом Пинкеля (Pinkel et al., 1986). В качестве зондов использовали фрагмент 18S рДНК и микродиссекционную ДНК, меченные биотин-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ методами, соответственно, nick-трансляции и ПЦР.

10. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.