WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Эффекты действия природных антимикробных пептидов и их синтетических аналогов с различными изменениями структуры молекулы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Артамонов Александр Юрьевич

ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ

14.03.03 – патологическая физиология

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2012

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Рыбакина Елена Георгиевна

кандидат медицинских наук, доцент Орлов Дмитрий Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

начальник научно-исследовательской лаборатории

клеточных и генных технологий Федерального

государственного военного образовательного

учреждения Высшего профессионального образования

«Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»

Министерства обороны Российской Федерации Александров Виктор Николаевич

Доктор биологических наук, заведующий лабораторией

№ 15 «Сравнительная биохимия ферментов» Федерального

государственного бюджетного учреждения «Институт

эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова»

Российской академии наук Морозов Владимир Игоревич

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Северо-Западный Государственный медицинский университет имени

И.И. Мечникова Минздравсоцразвития России

Защита состоится «____» марта 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «___» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Дыбан П.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Молекулярно-клеточные механизмы защитных функций в настоящее время являются предметом изучения большинства экспериментальных работ, создающих основу для формирования общих представлений о типовых защитных и компенсаторно-приспособительных реакциях организма (Корнева Е.А. и соавт., 2000).

Особое внимание уделяется семейству эффекторных и сигнальных биологически активных веществ – антимикробным пептидам, обеспечивающим реализацию защитных и приспособительных реакций при инфицировании, стрессорном воздействии (Korneva E.A. et al., 1997; Aberg K.M. et al., 2007), паразитарной инвазии (McGwire B.S. et al., 2010), опухолевом росте (Jin G. et al., 2010). Антимикробные пептиды (АМП) - группа биологически активных веществ, преимущественно продуцируемых нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, а также эпителиальными клетками барьерных органов. Эффекты их действия на клетки и ткани разнообразны и зависят от концентрации пептидов. Наиболее изученной является их непосредственная антимикробная биологическая активность, отражающая наиболее значимую роль этих пептидов в защитных функциях организма (Korneva E.A., Kokryakov V.N., 2003).

Одним из основных направлений исследования антимикробных пептидов в последнее десятилетие стало изучение молекулярных и клеточных механизмов их биологической активности, обеспечивающих участие АМП в реализации защитных функций организма (Кокряков В. Н., 2006). Антимикробные пептиды обладают уникальными свойствами: они селективно действуют на бактерии, поскольку их катионные молекулы имеют высокое сродство к мембранам бактерий, обогащенным отрицательно заряженными компонентами – липополисахаридом и др. Выработка у бактерий резистентности к АМП затруднена в связи с особенностями механизма их бактерицидного действия – быстрого, в течение минут, повышения проницаемости мембран микроорганизмов, утратой их барьерной функции, приводящей к осмотическому разрушению клеток (Orlov D.S. et al., 2002). АМП не задерживаются и не накапливаются в организме, их связывают и инактивируют белки плазмы, разрушают протеазы. Антимикробные пептиды не угнетают функции иммунной системы, а обладают различными иммуномодулирующими эффектами, например, свойством стимулировать активность естественных киллерных (ЕК) клеток, что может быть полезным при создании лекарственных препаратов (Chernysh S. et al., 2012). Эти особенности выгодно отличают природные петидные соединения от классически применяемых антибиотиков (Gordon Y. J., Romanowski E. G., 2005).

Однако клиническое применение АМП ограничивается сходным диапазоном эффективных концентраций пептидов как антимикробных средств и концентраций, при которых проявляется их токсическое действие на клетки человека. Положительные примеры удачных попыток практического использования природных АМП в традиционных лекарственных формах имеются, но только в качестве препаратов местного действия, используемых в виде аэрозоля, мази или таблеток для рассасывания. In vivo АМП действуют в составе сложного ансамбля молекул, чаще в ограниченном объеме – фагосоме, слое слизи барьерных органов.



Применение АМП возможно после изменения биологических свойств природных пептидов, и способом такого изменения может быть их структурная модификация, создание синтетических соединений с новыми эффектами действия. Однако так как структура АМП обуславливает их биологическую активность, молекулярно-клеточные механизмы действия синтетических аналогов природных пептидов требуют специального изучения.

Настоящая работа посвящена изучению возможностей получения антибиотических веществ на основе природных антимикробных пептидов со свойствами, оптимальными для поддержания защитных функций, наиболее перспективных для получения препаратов нового поколения.

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение антибиотической и иммуномодулирующей активности природных антимикробных пептидов и их синтетических структурных модификаций.

В задачи исследования входило:

  1. Изучение антибиотической и гемолитической активности протегрина-1 и его синтетических аналогов с измененным, по сравнению с природной молекулой, расположением дисульфидных связей.
  2. Исследование антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных аналогов.
  3. Сравнительное изучение эффектов действия природного индолицидина и его синтетических структурных модификаций на цитотоксическую и пролиферативную активность спленоцитов крысы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов получены новые данные, характеризующие антибиотические свойства природных антимикробных пептидов в сравнении с их синтетическими аналогами с измененным расположением дисульфидных связей. Приоритетный характер носят результаты исследования антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных модификаций. Впервые изучены изменения пролиферативной и цитотоксической активности спленоцитов крысы под действием индолицидина в сравнении с эффектами действия его синтетических аналогов различной структуры. В работе впервые использованы хромогенные и флюоресцентные маркеры для оценки антимикробной активности и возможного механизма антибиотического действия пептидов.

Проведенное экспериментальное исследование способствует формированию новых представлений о молекулярно-клеточных механизмах реализации защитных функций с участием катионных пептидов, обладающих антибиотическими и иммуномодулирующими свойствами. Практическая значимость исследования определяется проблемами и вопросами, стоящими перед современной медициной. По данным ВОЗ рост резистентности микроорганизмов к существующим антибиотикам делает необходимым разработку противомикробных препаратов нового поколения в ближайшие годы. Выявление модификаций пептидов с оптимальными антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, а также теоретическая разработка способов их получения, открывают возможность создания на их основе противомикробных, противовирусных, фунгицидных лекарственных препаратов (Чаттерджи П., Флек Ф., 2011). Полученные в работе данные также открывают перспективу для разработки путей коррекции нарушенных защитных функций с помощью антимикробных пептидов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Синтетические структурные аналоги протегрина-1 с измененным расположением дисульфидных связей обладают сниженной антимикробной и гемолитической активностью по сравнению с активностью природного пептида.
  2. Триптофан-богатые пептиды обладают высокой антимикробной активностью, которая усиливается при увеличении заряда молекулы. Пептиды 3В3, GSP-1, пуроиндилин А, Ind23, Ind34, Ind35, Ind36, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 проявляют низкую гемолитическую активность.
  3. Пептиды – аналоги индолицидина – с низкой токсичностью в отношении клеток К562 проявляют иммуномодулирующую активность: изменяют цитотоксическую активность ЕК-клеток и пролиферативную активность спленоцитов крыс.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования вошли в содержание курса лекций, читаемых на Кафедре патологии медицинского факультета и Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Методические подходы, разработанные в ходе исследования, применяются при изучении биологической активности пептидов в Отделе общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета, в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Конференции молодых ученых, посвященной 115-летию образования ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2006), Научно-практической конференции с международным участием «Ученые будущего» (Одесса, 2006), Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009, 2011), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов.





Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах и включает 39 рисунков, 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 229 источников, в том числе 15 работ на русском и 214 – на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общие условия работы. Общим условием работы было принятие необходимых мер, предотвращающих возможность бактериального загрязнения препаратов и растворов.

Экспериментальные животные, условия культивирования микроорганизмов, клеток крови человека и клеточных линий. В работе использованы микроорганизмы Escherichia coli, штамм ML-35p; Listeria monocytogenes, штамм EGD; Staphylococcus aureus, штаммы ATCC 33591 и 710а; Candida albicans, штамм 820, которые были предоставлены проф. Р. Лерером (Калифорнийский университет, Лос-Анжелес, США). Культуры бактерий хранили в среде на основе триптического гидролизата сои (TSB), грибков – на среде Сабуро. Микроорганизмы культивировали в жидких средах аналогичного состава в течение 18 ч. Эритроциты человека получали от здоровых доноров 20-30 лет. Клетки миелоидной эритролейкемии человека K562 предоставлены Институтом цитологии РАН (Санкт-Петербург). Спленоциты получали от крыс-самцов Wistar массой 180-200 г (Питомник «Рапполово», Санкт-Петербург). Крыс содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных.

Исследуемые пептиды являются представителями распространенного в природе семейства кателицидинов, обладающих высокой антимикробной активностью. В работе использованы представители двух подгрупп кателицидинов: пептиды с дисульфидными связями, обеспечивающими вторичную структуру бета-шпильки, и пептиды, обогащенные остатками триптофана. К первой подгруппе пептидов относятся природный протегрин-1 (PG-1), впервые полученный в Отделе общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Kokryakov V.N. et al., 1993) и его синтетические структурные аналоги с различным расположением дисульфидных связей P45, P88, P85 и P90, синтезированные проф. О.А. Миргородской (НИИ аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург). Представители второй подгруппы – природные и синтетические пептиды, характеризующиеся высоким содержанием триптофана (W): индолицидин (Ind), 3B3, GSP-1a, пуриндолин А (PuroA), тритриптицин, а также пептиды с остатками омега-аминокислот (Ind23, Ind34, Ind35, Ind36), различным зарядом молекулы и расположением гидрофобных и гидрофильных участков (Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21, Ind22).

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пептидов проводили с использованием ресазурина - хромогенного маркера метаболической активности размножающихся клеток, и методом радиальной диффузии в геле. При применении ресазурина пробы инкубировали при 37оС в течение 2 ч, одновременно на спектрофотометре проводили измерение их оптической плотности при длинах волн 570 и 600 нм. При определении МИК методом радиальной диффузии в геле, микроорганизмы инкубировали с пептидами, внесенными в лунки геля, в течение 24 ч. Для оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны лизиса вокруг мест внесения пептидов в гель. МИК пептидов вычисляли методом линейной регрессии.

Влияние пептидов на проницаемость внешней и внутренней мембран E. coli оценивали с помощью хромогенных и флуоресцентных маркеров проницаемости – субстратов для фермента лактамазы в периплазматическом пространстве и галактозидазы в цитоплазматическом пространстве микроорганизма. В качестве маркеров увеличения проницаемости внешней мембраны применяли Nitrocefin (Calbiochem-Novabiochem, USA) или CCF2-свободную кислоту (Aurora Bioscience, USA), внутренней – ONPG (Sigma) или DiFMUG (Invitrogen, USA).

Фотометрический метод оценки гемолитической активности антимикробных пептидов в отношении эритроцитов человека основан на измерении оптической плотности проб, содержащих гемоглобин, вышедший из лизированных эритроцитов, при длине волны 540 нм. В пробы крови добавляли гепарин или ЭДТА, осадок эитроцитов ресуспендировали в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,4, с содержанием 0,137 моль/л NaCl и 0,0027 моль/л KCl) и инкубировали с пептидами при 37°С в течение 30 мин.

Оценку цитотоксического действия пептидов проводили с использованием МТТ – хромогенного маркера метаболизма ферментов дыхательной цепи митохондрий. В клетках с активным метаболизмом МТТ переходит в восстановленную форму с максимумом поглощения при 540 нм. Пробы, содержащие клетки К562 в среде RPMI-1640 и исследуемые пептиды, инкубировали в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2 и 100% влажности. За 3 часа до окончания инкубации в лунки планшетов добавляли МТТ. По окончании инкубации к пробам добавляли изопропанол и 0,04 М HCl, оптическую плотность проб измеряли при 540 нм. Концентрацию IС50, при которой происходит ингибирование 50% клеток, вычисляли с помощью метода нелинейного регрессионного анализа.

Выделение спленоцитов из селезенки крыс. Животных декапитировали, извлекали селезенку и гомогенизировали ее. Суспензию спленоцитов в среде RPMI-1640 фильтровали, обрабатывали раствором 0,83% NH4Cl для лизирования эритроцитов, центрифугировали и ресуспендировали в такой же среде.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.