WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шамова

Ольга Валерьевна


Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов

14.03.03 – патологическая физиология

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2013

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

академик РАМН Корнева Елена Андреевна

доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор,

«Санкт-Петербургский институт биорегуляции

и геронтологии СЗО РАМН»,

руководитель лаборатории биогеронтологии Кветная Татьяна Викторовна

Доктор медицинских наук, профессор,

Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

"Санкт-Петербургский государственный медицинский

университет имени академика И.П. Павлова"

Министерства здравоохранения Российской Федерации,

профессор кафедры патофизиологии Шестакова Светлана Алексеевна

Доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

"Санкт-Петербургский государственный университет",

профессор кафедры биохимии Кулева Надежда Владимировна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «____» 2013 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « ___ » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Дыбан П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование молекулярных механизмов реализации функций системы врожденного иммунитета, привлекает все больший интерес, поскольку эта система не только обеспечивает немедленный ответ организма на вторжение патогенных микроорганизмов, но и участвует во многих других жизненно важных физиологических процессах, направленных на адаптацию организма при различных неблагоприятных воздействиях [Пигаревский, 1978; Маянский А., Маянский Д., 1989; Корнева, 2003; Кокряков, 1999; Черешнев, Черешнева, 2011; Кlebanoff, Clark, 1978; Lehrer et al,1988 Lehrer, Lu, 2012; Hancock et al., 2012]. Одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета являются катионные пептиды, содержащиеся преимущественно в лизосомоподобных гранулах нейтрофилов. Эти пептиды были открыты как соединения, обладающие выраженной антимикробной активностью [Lehrer et al., 1988; Zaslof et al., 1985; Boman et al., 1990], поэтому за ними закрепилось название «антимикробные пептиды» (АМП). Позднее было показано, что некоторые АМП нейтрофилов обладают более широким спектром биологической активности: стимулируют хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток [Huang et al., 1997; Biragyn et al., 2001]; дегрануляцию тучных клеток [Territo et al., 1988], увеличивают проницаемость сосудов и стимулируют их рост [Li et al., 2000]; влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов [Tkachenko et al., 1994; 1996] связывают бактериальный липополисахарид [Hancock et al., 1999]; влияют на процессинг IL-1 [Perregaux et al, 2002], ингибируют индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников, а также индуцированный -меланоцит-стимулирующим гормоном синтез альдостерона клетками надпочечников [Zhu et al., 1988; 1991], что дало основание рассматривать эти пептиды как возможные регуляторные молекулы, участвующие в механизмах взаимодействия систем врожденного и приобретенного иммунитета [Yang et al., 2004; Кокряков, 1999; 2006], а также иммунной и нейроэндокринной систем [Bateman et al., 1993].

АМП могут рассматриваться и как перспективная основа для создания новых антибиотических и иммуномодулирующих лекарственных препаратов, а детальное изучение биологических свойств различных представителей этого структурного класса пептидов является актуальным направлением исследований в экспериментальной медицине.

В связи с этим, представляет интерес также поиск и характеристика новых АМП лейкоцитов животных, и исследование эффектов этих пептидов на микроорганизмы, в том числе, устойчивые к традиционно используемым антибиотикам микробного происхождения; а также на нормальные и опухолевые клетки человека и млекопитающих, что позволяет выявлять ранее неизвестные структуры пептидов, обладающих свойствами, перспективными при разработке новых лекарственных средств.



Нейтрофильные гранулоциты являются доминирующей фракцией циркулирующих в крови лейкоцитов у человека и ряда млекопитающих, а при различных формах патологии (инфекционном процессе, дистрессе и других) происходит высвобождение содержимого их лизосомоподобных гранул во внеклеточное пространство, в том числе, АМП (причем концентрация этих веществ в крови повышается на один-два порядка). Однако, большинство исследований АМП нейтрофилов направлено на изучение их антимикробного действия, а действие их на собственные клетки организма остается малоизученным.

Необходимо отметить, что характер действия АМП на эукариотические клетки во многом зависит от концентраций этих веществ в среде. В концентрациях, в несколько раз больших, чем необходимые для проявления антимикробных эффектов, многие АМП оказывают токсическое действие в отношении собственных клеток организма; как нормальных, так и трансформированных. Уже в конце 80-х годов появились работы, посвя-щенные изучению действия пептидов из семейства дефенсинов на клетки макроорганизма, причем основное внимание было сосредоточено на исследовании их цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток в культуре [Lichtenstein et al., 1988, 1991]. Хотя в литературе широко обсуждается возможность создания противоопухолевых агентов на основе АМП [Lizzi et al., 2009; Mader, Hoskin, 2006], имеются лишь немногочисленные и достаточно противоречивые работы по исследованию механизмов цитотоксического действия этих пептидов на опухолевые клетки и выявлению мишеней их действия.

С другой стороны, интерес представляет изучение факторов, ограничивающих повреждающее действие АМП в случаях, когда их концентрация в крови или тканях становится критически высокой. Для дефенсинов человека было показано [Panyutich et al., 1995], что эти пептиды избирательно связываются с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), а также с некоторыми другими ингибиторами протеиназ, например, альфа2-макроглобулином; причем в результате такого связывания не только отменяются цитотоксические эффекты дефенсинов, но и снижается ингибирующее действие белков в отношении протеиназ. Информация о подобных взаимодействиях АМП, отличных по структуре от дефенсинов, с серпинами практически отсутствует. Исследование в этом направлении актуально не только для понимания механизмов защиты собственных клеток организма от повреждающего действия АМП, но и для анализа возможности участия АМП в регуляции биологической активности белков из семейства серпинов, которые выполняют в организме разнообразные функции, инициируя образование, модификацию и деградацию белков, участвующих в важнейших биохимических каскадах реакций, а также служат переносчиками разнообразных молекул, в том числе гормонов; и, таким образом, связывание с АМП может играть значимую роль в регуляции этих функций.

Циркулирующие в кровяном русле или присутствующие в различных тканях нейтрофилы находятся в окружении других клеток системы врожденного и приобретенного иммунитета, в частности, тех, которые на настоящий момент рассматриваются как основные участники противоопухолевой защиты организма – естественные киллерные клетки и цитотоксические Т-лимфоциты. Осуществляя свои защитные функции, они могут оказаться в непосредственном контакте с биологически активными молекулами, секретируемыми нейтрофилами. Возникает вопрос, могут ли АМП нейтрофилов модулировать активность этих клеток, однако работы в этом направлении практически отсутствуют. Поэтому важной задачей является изучение как прямого цитотоксического действия АМП, так и выяснение воможности их взаимодействия с другими эффекторными звеньями системы врожденного и приобретенного иммунитета.

В последние годы получило развитие одно из актуальных направлений биологии и медицины - изучение пептидов, проникающих в эукариотические клетки (Cell-penetrating peptides). В связи с этим представляют интерес данные о свойстве ряда АМП в низких нецитотоксических концентрациях, проникать через клеточные мембраны, не повреждая клетки, и накапливаться в их цитоплазме [Takeshima et al., 2003; Tomasinsig, et al., 2006]. Пока информация о таких эффектах АМП ограничивается немногочисленными работами. Однако подобное свойство АМП представляется исключительно важным, так как, попадая в цитоплазму клетки, пептиды могут влиять на разнообразные внутриклеточные процессы, обеспечивающие ее жизнедеятельность. Изучение интернализации пептидных молекул во внутриклеточное пространство имеет и практическое значение, так как эти пептиды могут рассматриваться, как возможные прототипы для создания молекул-переносчиков различных лекарственных средств через мембраны опухолевых клеток.

Кортикостатическое действие АМП определяется их свойством связываться с рецепторами к АКТГ на клетках надпочечников в культуре, выступая в роли конкурентных ингибиторов этих гормонов и блокируя АКТГ-индуцированный синтез кортикостероидов [Zhu et al., 1992], а также стимулированный -меланоцитстимулирующим гормоном (-МСГ) синтез альдостерона [Solomon, 1993]. Интересно, что кортикостатические эффекты дефесинов наблюдались и на моделях in vivo [Шамова и др, 1993; 1995]. При этом, известно, что рецепторы к производным проопиомеланокортина (АКТГ, -МСГ и другим) имеются и на лейкоцитах (моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, лимфоцитах, тучных клетках). Известно также, что -МСГ проявляет спектр эффектов в отношении клеток системы врожденного, а также приобретенного иммунитета: ингибирует фагоцитоз и секрецию хемокинов макро-фагами и нейтрофилами; подавляет миграцию нейтрофилов и макрофагов в очаг воспаления; ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов моноцитами и макрофагами, усиливает продукцию факторов, подавляющих воспаление; то есть обладает противовоспа-лительным действием. В связи с этим представляется важным выяснить, способны ли АМП модулировать эффекты -МСГ, обусловливающие его противовоспалительное действие. Работа в этом направлении позволит сформировать представления об участии антимикроб-ных пептидов нейтрофильных гранулоцитов, как в процессах взаимодействия систем врожденного и приобретенного иммунитета, так и в процессах нейроиммуномодуляции.





В гранулах нейтрофилов каждого из изученных видов млекопитающих содержится спектр катионных пептидов, имеющих различную структуру и разную степень антибиотической и других форм биологической активности. Например, из шести дефенсинов кролика два пептида NP-1 и NP-2 имеют выраженные антибиотические эффекты, в то время как два других, NP-3a и NP-3b демонстрируют кортикостатическую активность, а NP-4 и 5 имеют низкую антимикробную и кортикостатическую активности. Таким образом, можно предположить, что разнообразие АМП в нейтрофильных гранулоцитах обусловлено тем, что различные АМП выполняют разные функции, и каждое вещество играет определенную роль в развитии конкретных патологических процессов - некоторые участвуют в прямой инактивации микроорганизмов, в то время как другие обладают свойствами биомодуляторов, влияя на активность эффекторных молекул различных систем организма.

Целью работы являлись поиск и характеристика новых антимикробных пептидов лейкоцитов животных и изучение молекулярно-клеточных основ реализации биологической активности пептидов (бактенецинов, аципенсинов, протегрина, дефенсинов) в защитных реакциях, развивающихся при различных патологических процессах (инфекционном процессе, воспалении, опухолевом росте).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Осуществить поиск, выделение, очистку и анализ физико-химических свойств новых антимикробных пептидов (АМП) из клеток крови животных: рыб (осетра, севрюги), млекопитающих (домашней козы); изучить антимикробное действие этих пептидов.
  2. Оценить цитотоксическое действие различных по структуре и механизмам антимикробного действия АМП (протегрина 1, бактенецинов, аципенсинов) на опухолевые и нормальные клетки в культуре. Исследовать эффекты действия пептидов протегрина и бактенецина на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток в отношении опухолевых клеток в культуре.
  3. Исследовать механизмы действия АМП на культивируемые клетки: изучить динамику цитотоксического действия; исследовать возможность участия антимикробных пептидов в инициации процесса апоптоза клеток; изучить процесс транслокации пептидов (протегрина, бактенецина), несущих флуоресцентную метку, в опухолевые клетки; оценить зависимость этого процеса от температуры и энергетического обмена клеток-мишеней, а также роль эндоцитоза в этом процессе.
  4. Изучить влияние факторов, ограничивающих цитотоксическое действие пептидов, в частности, исследовать взаимодействие АМП с белками-серпинами и возможность модулирования в результате такого взаимодействия биологической активности пептидов, с одной стороны, и функциональной активности серпинов, с другой.
  5. Изучить эффекты АМП, имеющих низкую токсичность для эукариотических клеток, на пролиферативную активность фибробластов кожи человека и скорость заживления кожных ран у экспериментальных животных.
  6. Провести исследование влияния дефенсинов на эффекты -меланоцит-стимулирующего гормона (-МСГ), обусловливающие его противовоспалительное действие: изучить влияние пептидов на опосредованное -МСГ ингибирование фагоцитоза и секрецию интелейкина 1 нейтрофилами, а также на способность -МСГ подавлять миграцию нейтрофилов в очаг воспаления на модели экспериментального асептичекого воспаления у мышей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Открыты и охарактеризованы по физико-химическим и функциональным свойствам новые антимикробные пептиды системы врожденного иммунитета животных: бактенецины ChBac5, ChBac3.4, mini-ChBac7.5N, mini-ChBac7.5N из лейкоцитов козы; аципенсины из лейкоцитов русского осетра (Ас 1, Ас 2, Ас 3, Ас 4, Ас 5, Ас 6) и севрюги (Ас 2 и Ас 3).

2. Открытые антимикробные пептиды (бактенецины, аципенсины) и протегрин проявляют высокую антимикробную активность, в том числе и в отношении антибиотико-устойчивых штаммов. Антибактериальная активность бактенецинов повышается при их совместном применении с другими антибиотическими агентами (рифампицином, наночастицами серебра). Антимикробное действие бактенецинов и аципенсинов реализуется без существенного нарушения барьерной функции цитоплазматической мембраны Е.coli ML-35p; пептид ChBac3.4, отличающийся повышенной гидрофобностью молекулы, оказывает более выраженное повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану E.coli.

3. Исследуемые в работе антимикробные пептиды проявляют липополисахарид-связывающую активность.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.