WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Функциональный анализ mads-белков астровых, регулирующих цветение, и перспективы их использования в биотехнологии растений

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Головешкина Елена Николаевна

Функциональный анализ MADS-белков Астровых, регулирующих цветение, и перспективы их использования в биотехнологии растений

Специальность: 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии), 03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА  2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Центр «Биоинженерия» РАН

Научные руководители: кандидат химических наук

Шульга Ольга Альбертовна

кандидат биологических наук

Камионская Анастасия Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Соловьев Александр Александрович

кандидат биологических наук

Чернобровкина Мария Аркадьевна

Ведущая организация: Станция искусственного климата «БИОТРОН», Филиал учреждения РАН института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ)

Защита диссертации состоится “UUU08U” UфевраляU U2012U г. в U14 час. 30 мин.U на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49.

Факс: (499) 976-08-94

e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте U http://timacad.ru

Автореферат разослан «29» декабря 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.С. Большакова

0BОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Покрытосеменные господствуют на большей части суши и играют решающую роль в формировании растительного покрова. Их обитание в различных экологических условиях во всех климатических зонах объясняется поразительной пластичностью онтогенеза этих растений, что отражается в изменениях их структуры. Важнейшим событием, ознаменовавшем возникновение покрытосеменных, стало появление цветка. И произошло это, согласно общепринятому мнению, в результате эволюционных изменений в последовательности генов, кодирующих MADS-box факторы транскрипции, что сопровождалось изменениями в механизмах контроля экспрессии как самих факторов, так и транскрипции их генов-мишеней. Поэтому сегодня особое внимание сфокусировано на MADS-белках, которые регулируют многие процессы развития растений, в частности, переход растения к репродуктивной стадии развития и последующий морфогенез цветка.

Функциональные исследования MADS-box факторов транскрипции свидетельствуют о том, что структурная гомология сопровождается сходством функции, но при этом имеются свои особенности, что обуславливает морфологию конкретного вида растений. В частности, было продемонстрировано, что конститутивная экспресcия MADS-генов групп SQUAMOSA (SQUA) и AGL2 (SEPALLATA, SEP) изменяет сроки цветения у модельных и сельскохозяйственных растений. Ранее в нашей лаборатории были клонированы кДНК семи MADS-генов Астровых, гомологичных генам SQUA и AGL2. Для двух из них был проведен функциональный анализ кодируемых ими белков в модельных растениях A. thaliana. Функции MADS-белков Астровых SQUA- и AGL2-групп мало изучены. Целью нашей работы стала характеристика всей группы указанных генов в модельном растении N. tabacum.

Выяснение общих основ и частных особенностей генетического контроля генеративного развития растений разных видов имеет несомненную фундаментальную значимость. Характер влияния эктопической экспрессии MADS-генов указывает на практическую ценность подобных экспериментов как оценивающих возможность использования этих генов в биотехнологии растений. И то, и другое подчеркивает актуальность сравнительного изучения функциональной роли MADS-факторов транскрипции Астровых.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение функциональной роли MADS-факторов транскрипции (группы SQUA) гомологичных AP1, FUL и SEP из хризантемы (CDM111, CDM41, CDM8 CDM77, CDM44; Shchennikova et al., 2004) и подсолнечника (HAM92, HAM75; Шульга и др., 2008).

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

  1. Провести сравнительный структурно-филогенетический анализ использованных в работе MADS-белков хризантемы и подсолнечника.
  2. Получить модельные трансгенные растения табака Nicotiana tabacum сорта Samsun NN с MADS-факторами транскрипции Астровых.
  3. Изучить влияние конститутивной экспрессии MADS-генов Астровых CDM111, CDM41, CDM8, CDM77, CDM44, HAM92, HAM75 на вегетативное и генеративное развитие модельных растений табака.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен анализ функциональной роли MADS-факторов транскрипции (группы SQUA) гомологичных AP1, FUL и SEP из хризантемы CDM111, CDM41, CDM8 CDM77, CDM44 и подсолнечника HAM92, HAM75. Показано, что конститутивная экспрессия генов Астровых, кодирующих белки AP1/FUL, приводит к ускорению наступления фазы цветения в трансгенных растениях табака Nicotiana tabacum L., что свидетельствует о консервативности процессов, происходящих в растениях разных видов. Тем не менее, гомологи FUL из хризантемы не проявили своего участия в дифференцировке клеток плода. Продемонстрирована значимость порогового уровня экспрессии для функции гомологов АР1: HAM75 и HAM92. Анализ влияния экспрессии CDM44 и CDM77 на онтогенез растений показал функциональное сходство CDM44 и SEP3, участие CDM44 в регуляции скорости клеточного деления и возможную узкую специализацию для CDM77. Изменение сроков цветения у модельных растений без существенного влияния на урожайность при конститутивной экспрессии генов MADS-факторов транскрипции (группы SQUA), таких как CDM111, CDM41, CDM8, CDM44, HAM92, HAM75, делает их перспективными кандидатами для создания новых форм различных сельскохозяйственных культур с измененными сроками развития.



Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

  1. MADS-белки Астровых АР1/FUL- и SEP-групп участвуют в определении времени зацветания растения;
  2. Белки Астровых, подобные АР1, FUL и SEP, не влияют на закладку цветковых органов в трансгенных растениях табака.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях: «Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур» (Москва, 2006); «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); «Plant Gene Discovery Technologies» (Вена, 2011); а также на Съезде генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина (Москва, 2009), и на школах: 10 школе-конференции (Пущино, 2006); VII Молодежной научной школе-конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2007); 11 Международной школе-конференции (Пущино, 2007); II Международной Школе «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007); XV Школе по биологии развития (2008); Всероссийской научной школе «Горизонты нанобиотехнологии» (Москва, 2009). По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ: две статьи в рецензируемых отечественном (1) и международном (1) журналах, рекомендованных ВАК, и 13 тезисов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 185 источников. Иллюстративный материал состоит из 13 таблиц и 22 рисунков.

Благодарности. Автор глубоко признателен научным руководителям Шульге О.А. и Камионской А.М. и Щенниковой А. В. за неоценимую помощь в работе.

9BМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы: штаммы A. tumerfaciens GV3101; растения Nicotiana tabacum L. сорта Samsun NN; вектора pGD121::ген (CDM111, CDM41, CDM8, CDM44, CDM77, HAM75, HAM92) для трансформации растений. Сравнительный и филогенетический анализ последовательностей MADS-генов осуществляли с помощью программ BLAST (Altschul et al., 1997), ClustalX (Larkin et al., 2007). Растения табака трансформировали согласно Horsch et al. (1984). Геномную ДНК из растений выделяли по Dellaporta et al. (1987). ПЦР проводили согласно Головешкиной с соавт. (2010). Выделение и ОТ-ПЦР анализ мРНК тканей табака проводили согласно протоколу фирмы QIAGEN. Статистическую обработку данных проводили по Доспехову (1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1BТрансгенные растения табака с экспрессией MADS-генов Астровых

Предметом нашего исследования являются гены, кодирующие MADS факторы транскрипции представителей семейства Астровых – хризантемы (Chrysanthemum morifolium L., CDM111, CDM41, CDM8, CDM77, CDM44; Щенникова и др., 2003) и подсолнечника (Helianthus annuus L., HAM92, HAM75; Шульга и др., 2008). Поскольку эти культуры отличаются сравнительно низкой эффективностью трансформации, мы проанализировали функции белков CDM и HAM, получив трансгенные модельные растения табака Nicotiana tabacum cv. Samsun NN с конститутивной экспрессией перечисленных выше MADS-генов.

Для экспрессии анализируемых белков мы использовали промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, который активен во всех тканях двудольных растений (Odell et al., 1985; Sunilkumar et al., 2002). Полученные нами в результате агробактериальной трансформации и селекции на среде с канамицином регенеранты проверили методом ПЦР на присутствие в геноме трансгенов (рис. 1) и отсутствие агробактериального заражения. 86 отобранных трансгенных растений Т0 (18 – 35S::HAM75, 20 – 35S::HAM92, 6 – 35S::CDM111, 3 – 35S::CDM44, 11 – 35S::CDM41, 8 – 35S::CDM8, 20 – 35S::CDM77) и нетрансгенные растения, полученные в ходе регенерации, выращивали в теплице до получения семенного материала Т1.

 Электрофорез продуктов ПЦР с праймерами, специфичными к-0





Рисунок 1. Электрофорез продуктов ПЦР с праймерами, специфичными к последовательностям промотора 35S CaMV и терминатора NOS

М – маркер молекулярной массы ДНК (2000 и 850 н.п.); 1, 21, 32 – без ДНК-матрицы; 2 – ДНК плазмиды pGD121::HAM75; 3 – ДНК нетрансгенного табака; 4-16, 27, 28 – ДНК растений 35S::HAM92; 17–20 – ДНК растений 35S::CDM8, 22 – ДНК плазмиды pGD121::CDM111; 23–26 – ДНК растений 35S::HAM75; 29–31 – ДНК растений 35S::CDM111.

2BРасщепление в поколении Т1 трансгенных растений табака

Экспрессия трансгена зависит от числа копий, района интеграции в геноме, характера вставок (отдельно или в составе тандема – в прямой или обратной ориентации) и др. (Scheid et al., 1991; Matzke et al., 1994, Jones et al., 1987, Wang et al., 2000). При агробактериальной трансформации в геном растения может интегрировать до нескольких копий вставки. По признаку устойчивости к канамицину мы отобрали 17 линий с расщеплением 3:1 и линию 92-3 с расщеплением 15:1, что предполагает однолокусную и независимую двухлокусную интеграции, соответственно (табл. 1). По 10 устойчивых к канамицину проростков Т1 каждой линии проверили с помощью ПЦР на наличие трансгена.

Таблица 1. Расщепление поколения Т1

линия

KmR, шт

KmS, шт

взошло, шт

H0

2факт..

2теор.

CDM8-1*

231

69

300

3:1

0,6

3,84

CDM8-2*

235

65

300

3:1

1,7

3,84

CDM8-5*

216

84

300

3:1

1,44

3,84

Продолжение таблицы 1

CDM8-3

0

28

300

-

-

-

CDM41-1

260

40

300

3:1/15:1

21,7/25,7

3,84

CDM41-12*

220

80

300

3:1

0,4

3,84

CDM44-1*

214

86

300

3:1

2,6

3,84

CDM44-2*

227

73

300

3:1

0,7

3,84

CDM111-5*

216

84

300

3:1

1,44

3,84

CDM111-6

282

18

300

3:1/15:1

57,76/0,03

3,84

CDM77-1*

230

70

300

3:1

0,4

3,84

CDM77-2*

226

74

300



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.