WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 |

Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах triticum l. и iris l.

-- [ Страница 2 ] --

В виду большего количества информативных сайтов, равномерного нуклеотидного состава и нейтральной природы эволюции в дальнейшей работе были выбраны два некодирующих участка хлоропластной ДНК, trnL интрон и trnL-trnF межгенный спейсер. Инсерции и делеции, обнаруженные в результате выравнивания последовательностей, использовались для подтверждения топологии дерева в качестве бинарных характеристик. Филогенетический анализ был проведен с использованием всех 22 нуклеотидных последовательностей сибирских видов ирисов и Paradonthopsis dichotoma для каждого района отдельно вследствие возможно различной скорости эволюции и разного нуклеотидного состава. Но так как топологии деревьев, построенные на основе последовательностей разных участков, были подобны, мы объединили данные и построили дерево на основе общего выравнивания в 971 нуклеотид (рис. 2). Опираясь на полученные филогенетические деревья и распределение инсерций и делеций, предполагая маловероятным событие, что одна и та же инсерция или делеция произойдет несколько раз в различных ветвях независимо, все виды можно сгруппировать в 8 кластеров.

 Филогенетические взаимоотношения сибирских ирисов, основанные на-1

Рисунок 2. Филогенетические взаимоотношения сибирских ирисов, основанные на сравнительном анализе некодирующих последовательностей trnL-trnF района. Символами обозначены различные делеции и инсерции, произошедшие в определенной таксономической группе.

Спорной осталась локализация только I. ensata, которая отлична на деревьях, построенных на основе двух различных наборов последовательностей. Pardanthopsis dichotoma был более близок к внешнему таксону, чем к видам рода Iris на всех деревьях. Это подтверждает его отличие от видов рода Iris и выделение в отдельный род (Lenz, 1972; Lyte, 1997). Все сибирские ирисы формируют две основные ветви, соответствующие подроду Limniris (безбородые ирисы, I) и подроду Iris (бородатые ирисы, II, III, IV) по классификации Мэтью (Mathew, 1989).

В существующих системах рода Iris группы видов подобны, но размер и таксономический ранг кластеров в системе различны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989). В результате RAPD анализа все включенные в исследование виды группировались в три группы, соответствующие подродам Iris, Limniris, Xyridon по классификации Родионенко (1988) ( рис. 1). Однако результаты более надежного и полного (изучено почти вдвое большее количество видов) анализа нуклеотидных последовательностей подтверждают классификацию Мэтью. Виды, входящие в кластеры 4 (I. hallophila, I. ludwigii) и 7 (I. pallasii, I. lactea, I. biglumis), несмотря на то, что формируют отдельные кластеры, являются очень близкими другим видам подрода Limniris. Это показывает выделение этих видов в отдельные подрода Xyridon sensu lato по Родионенко (1988), Eremiris sensu lato по Доронькину (1987) необоснованным.

Филогения рода Triticum.

Настоящее изучение филогенетических взаимоотношений внутри рода Triticum состояло из двух частей: на первом этапе были проанализированы выбранные участки хлоропластной ДНК пшениц и близкородственных видов рода Aegilops, а затем - изучена вариабельность двух генов ядерных геномов. Одной из важных задач был поиск подходящего маркера для эволюционных исследований рода Triticum. Ранее было показано уменьшение генетического разнообразия пшениц вследствие доместикации, характеризующейся ограниченными размерами популяции с интенсивным отбором в сторону хозяйственно важных признаков (Tanskley, McCouch, 1997).

Район хлоропластных генов trnT (tRNA - Thr) и trnL (tRNA - Leu) вместе с промежуточными некодирующими участками был успешно использован нами при исследовании эволюционных взаимоотношений видов рода Iris. Анализ последовательностей этого района шести видов пшениц (T. urartu, T. monococcum, T. boeoticum, T. araraticum, T. dicoccoides, T. aestivum GenBank, AB042240) и некоторых эгилопсов: Ae. tauschii (AF519113), Ae. speltoides (AF519112) и Ae. uniaristata Vis. (AF519114) показал недостаточное количество полиморфных сайтов для филогенетического исследования. Вместе с тем в последовательноcтях trnL интрона видов Ae. speltoides, T. aestivum, T. araraticum и T. dicoccoides была обнаружена инсерция в 10 п.н. (AAACTCATAA), а в последовательностях диплоидных пшениц (T. urartu, T. monococcum, T. boeoticum ) - три нуклеотидные замены (G217 - A217, G319 - T319, A474 - C474). Это позволяло разделить полученные последовательности на три группы: (i) диплоиды, (ii) полиплоиды и Ae. speltoides, (iii) два других эгилопса, подтверждая гипотезу о родственности геномов Ae. speltoides и полиплоидных пшениц.

TrnK интрон с внутренним matK геном хпДНК как маркер для реконструкции филогении.

В целях поиска более подходящего и вариабельного филогенетического маркера был рассмотрен другой участок хпДНК – trnK интрон с внутренним matK геном. Для амплификации района длиной 2.6 тыс. п.н. нами были выбраны три пары праймеров. Из всех трех участков для 6 видов рода Triticum (T. boeoticum, T. monococcum, T. sinskajae, T. urartu, T. dicoccoides, T. araraticum) и двух – рода Aegilops (Ae. squarrosa, Ae. speltoides) второй участок, длиной 960 п.н., включающий часть matK гена, оказался наиболее вариабельным. Множественное выравнивание последовательностей выбранного участка для всех 45 видов включало 523 позиции, из которых 31 была вариабельная, а также были обнаружены инсерции и делеции. Проведенный филогенетический анализ представлен на рис. 3.



Рисунок 3. Филогенетический анализ видов рода Triticum, на основе сравнения последовательностей matK гена. Синтетические амфиплоиды выделены жирным шрифтом. На основе наличия или отсутствия специфической 10 п.н. инсерции в trnL интроне виды с инсерцией заключены в сплошную рамку, виды без инсерции – в рамку, составленную из точек. Звездочками обозначены последовательности из базы данных GenBank.

Так как филогенетический анализ пшениц выполнен на основе сравнения последовательностей хпДНК, построенное дерево отражает эволюционные события внутри рода Triticum согласно происхождению хлоропластных последовательностей. Тем не менее, каждая из четырех филогенетических групп включает виды, которые не только наследуют один и тот же плазмон, но в их геномной формуле присутствует также общий ядерный геном (рис. 3). Для полиплоидных видов (групп I, II) это может означать, что для каждой группы существовало материнское растение, которое в процессе видообразования на последнем этапе гибридизации являлось донором ядерного генома и плазмона одновременно. Обоснованностью этого предположения служат ранее полученные данные о наследовании хлоропластного генома T. timopheevii вместе с ядерным G геномом в результате гибридизации между Ae. speltoides и T. boeoticum (Chen et al., 1975).

Все диплоидные виды рода Triticum кластеризуются отдельно от остальных видов рода и четко отделяются от видов рода Aegilops (группа III и IV, рис. 3). Это подтверждается наличием уникальных нуклеотидных замен в последовательности trnL интрона диплоидных пшениц. Обе группы произошли от общего предка после дивергенции от предка групп I и II и формируют общий кластер, что доказывает близкое родство диплоидных видов родов Triticum и Aegilops.

Все полиплоидные виды, содержащие B и G геномы в геномной формуле, делятся на две отдельные группы (рис. 3). Такой результат подтверждает предположение о дифилетическом происхождении полиплоидных пшениц, основанном на гибридологических, цитологических и молекулярно-биологических данных (Lilienfeld, Kihara, 1934; Mori et al., 1995; Kilian et al., 2007). И это разделение произошло после дивергенции их предка и предковой формы A, D и других изученных геномов рода Aegilops (U, Sb, Sl и Ss). Более того, исходя из топологии дерева и кластеризации видов геном S Ae. speltoides наиболее близок к геномам B и G.

Филогенетические отличия между Ae. speltoides, эгилопсами секции Sitopsis и дикими диплоидными пшеницами

Результаты филогенетического анализа показывают очевидное отличие хлоропластного генома Ae. speltoides (II группа) от других видов рода Aegilops (IV группа) и диплоидных видов рода Triticum (III группа). Обе последовательности интронов (trnL и trnK) Ae. speltoides более вариабельны, чем гомологичные последовательности других эгилопсов и диплоидных пшениц. Этот факт полностью совпадает с предыдущими результатами, полученными на основе сравнения четырех других, некодирующих районов хпДНК и микросателлитных повторов (Yamane, Kawahare, 2005). Топологии деревьев в обоих исследованиях демонстрируют, что предковая форма Ae. speltoides отделилась раньше, чем произошла дивергенция диких диплоидных пшениц и эгилопсов (см. рис. 3). Это подтверждает гипотезу о выделении Ae. speltoides в отдельный род.

Эволюционное родство видов группы Timopheevii и Ae. speltoides

На основе анализа последовательностей выбранного в данной работе филогенетического маркера (участок matK гена) было получено четкое разделение полиплоидных видов пшениц на две эволюционные линии (Emmer и Timopheevii), которые являются сестринскими группами (рис. 3). Из всех проанализированных эгилопсов секции Sitopsis единственный вид Ae. speltoides, составляя общий кластер со II группой, является наиболее близким видом эгилопсов обеим сестринским группам. На основе наших результатов, и учитывая предыдущие работы (Wang et al., 1997; Бадаева, 2000; Hedgcoth et al., 2002) было установлено, что предковая форма Ae. speltoides тесно связана с эволюционной историей полиплоидных пшениц.

Геном G и плазмон видов секции Timopheevii (группа II), вероятно, наиболее молодые в эволюционном плане и наиболее близки современному Ae. speltoides. В настоящей работе при анализе последовательностей Pgk-1 гена различных геномов пшениц и эгилопсов была обнаружена специфическая инсерция размером 89 п.н. в интронах G и S геномов T. timopheevii и Ae. speltoides. Этот факт может служить дополнительным доказательством происхождения G генома от генома Ae. speltoides.

Кроме того, была выявлена внутривидовая вариабельность Ae. speltoides по этой последовательности, а также по другим маркерам (Breiman et al., 1991, Huang et al., 2002). Внутривидовая вариабельность, возможно, является причиной существования двух предковых форм, которые стали источником двух различных эволюционных линий полиплоидных пшениц. Возможное существование второй формы Ae. speltoides показано в PCR-SSCR анализе плазмона 6 видов рода Triticum и Aegilops, где только один вид эгилопсов, Ae. speltoides, был включен в группу Emmer (Wang et al., 1997).

Кластеры видов с В и G геномами распадаются, и чтобы получить достоверную информацию относительно дифилетического происхождения пшениц от двух различных образцов Ae. speltoides, оба эти растения необходимо включить в исследование и показать их родство с обеими группами видов. Маркер, использованный в данной работе, позволяет провести такое более детальное исследование и может считаться перспективным для анализа дифилетического происхождения полиплоидных пшениц.





Наследование хпДНК пшениц и эгилопсов по материнской линии

Возможность изучения синтетических видов пшениц на молекулярном уровне позволяет получать более точную информацию, а также подтверждать ранее известные данные о путях их происхождения (схемах гибридизации). В настоящее время известно, что наследование цитоплазматических (пластидных, митохондриальных) геномов не является строго материнским. У разных организмов наследование цитоплазматических геномов осуществляется с помощью различных механизмов (Birky, 1995; Korpelainen, 2004). Тем не менее, в результате филогенетического анализа, проведенного в данной работе, мы показали строго материнское наследование пластид всех изученных видов синтетических амфиплоидов (рис. 3).

Использование ядерной ДНК как молекулярного маркера

Полиплоидия существенно усложняет филогенетические исследования, основанные на ядерных последовательностях. В этом случае необходим дополнительный этап клонирования и информация о специфических характеристиках каждого генома, чтобы было возможно отделять его от других. Однако, информация о делециях, инсерциях и нуклеотидных заменах в разных геномах могут быть использованы для выбора праймеров, специфичных для каждого генома в отдельности. Проблема заключается только в наличии подходящих гомологичных последовательностей из разных геномов в базе данных. Для того чтобы выполнить поставленную задачу был проведен поиск доступных последовательностей у видов рода Triticum в базе данных GenBank. Последовательности генов Acc-1 и Pgk-1 (GenBank, AF343496 - AF343536 и AF343474 - AF343495 соответственно) были получены ранее для всех четырех геномов (Huang et al., 2002) и были использованы в настоящем исследовании. После их выравнивания были обнаружены специфические для каждого генома пшениц нуклеотидные замены, инсерции и делеции, на основе которых выбраны 6 пар геном-специфичных праймеров. В последовательностях Acc-1 гена показаны B геном-специфическая делеция размером 11 п.н. (рис. 4А) и А геном-специфическая делеция размером 46 п.н. (рис. 5).

A.

 Б. еста отжига праймеров (Acc3T sense, Acc3T antisense) для В-3

Б.

 еста отжига праймеров (Acc3T sense, Acc3T antisense) для В-4

Рисунок 4 Места отжига праймеров (Acc3T sense, Acc3T antisense) для В геном-специфичной амплификации и электрофорез продуктов амплификации Acc-1 гена у пшениц и близкородственных видов А. Полиплоидные пшеницы; Б. Диплоидные пшеницы.

В выравнивании Pgk-1 гена были обнаружены две перестройки (5 п.н. делеция и 6 п.н. инсерция), специфические для A генома пшениц (рис. 6), а также - 89 п.н. инсерция, которая была общей только для G и S геномов T. timopheevii и Ae. speltoides, соответственно.

 Места отжига одной из пар праймеров для А геном-специфичной-5

 Места отжига одной из пар праймеров для А геном-специфичной-6

Рисунок 5. Места отжига одной из пар праймеров для А геном-специфичной амплификации и электрофорез продуктов амплификации Acc-1 гена у пшениц и близкородственных видов с праймерами (Acc1T(2T) sense, Acc2T antisense). Буквами D, S, G, B, A в выравнивании обозначены последовательности геномов полиплоидных пшениц (B, G, D, A) и Ae. speltoides (S).

Специфическая амплификация В генома пшениц.

Для амплификации участка Acc-1 гена, принадлежащего B геному, были сконструированы соответствующие праймеры (рис. 4А). В ПЦР анализ были включены все виды из кластера I и синтетические виды из других кластеров (рис. 3), которые имели в своей геномной формуле B геном. Все полученные последовательности были идентичны и по наличию специфических нуклеотидных замен принадлежали В геному. Полученные данные позволяют четко разделять B и G геномы, и демонстрируют возможность селективной амплификации определенных геномов в полиплоидном организме (рис. 4А).

 Полиморфные позиции в выравнивании последовательностей Pgk-1-7

Рисунок 6. Полиморфные позиции в выравнивании последовательностей Pgk-1 гена, специфичные для различных геномов полиплоидных пшениц (А, В, G и D), генома Ae. speltoides (S) и трех гаплотипов диплоидных видов (I, II, III). Цифрами сверху обозначены позиции в общем выравнивании.

Происхождение A генома пшениц.



Pages:     | 1 || 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.