WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов

-- [ Страница 2 ] --

2.2. Результаты исследований


2.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах

в суспензии и на микроносителях


Глубинное суспензионное культивирование в биореакторе

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80, ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25 л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и ин­дивидуальными модулями технологической обвязки и управления, разработки и изготовления ВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль и регулирование процесса культивирования осуществлялся по основным техно­логическим параметрам, приведенным в табл. 1.

Использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соответственно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см3 – 0,9-1,3106.

Таблица 1

Основные контролируемые и регулируемые параметры глубинного

процессов культивирования клеток животных в биореакторах

Наименование параметра Единица измерения Текущее значение Допустимые отклонения
Температура культивирования Температура стерилизации Температура в термостате Расход воздуха рН, едрН Скорость вращения мешалки Концентрация СО2 Резерв еН рО2 рСО2 Давление в биореакторе Давление в рубашке биореактора Град0С « « об/об мил об/мин % мв кПа кПа ати ати 37,35 122,00 38,05 0,5-2,0 7,20 45,84 1,16 63,60 16,01 5,71 0,29 0,128 +0,50С +1,00С +0,30С +1% +0,1ед рН +1% +0,05 +10 мв +10 % +10 % +5% +10%

Культивирование клеток в биореакторе на микроносителях

При крупномасштабном выращивании культур клеток и вирусов основным критерием продуктивности процесса является обеспечение физиологических потребностей культур клеток, которые зависят от применяемого способа культивирования. Во ВНИТИБП разработаны процессы крупномасштабного культивирования клеток в биореакторах различных конструкций с модулем технологической обвязки и блоком автоматического управления основными параметрами (tк, tст, рН, еН, рО2, рСО2, давление, расход воздуха на аэрации и др.). На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителе «Cytodex» (табл. 2).

Таблица 2

Средняя продуктивность различных систем

№ п/п Системы культивирования Съем клеток с 1 мл питательной среды
1 Биореактор с перемешиванием и протоком среды 5106
2 Эрлифтный биореактор 5106
3 Биореактор с биофильтром и протоком среды 7106
4 Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Cytodex» 107 (перфузия)
5 Биореактор с пористыми ячейками 108 (перфузия)
6 Биореактор с полыми волокнами 108 (перфузия)
7 Мембранные биореакторы (керамический модуль) 109 (перфузия)

культивирования клеток животных

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов выбран метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях.

В результате 5-ти культивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2.



В целях масштабирования процессов культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосред­ственно в биореакторах. При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в 25 л биореакторе установлено, что опти­мальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Рас­пределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом количест­во прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рас­считанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, со­ставлял 4,2.

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для куль­тивирования клеток животных и вирусов уделяли харак­теристикам их конструктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродинамическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении асептических условий при дли­тельном культивировании путем сравнения существующих систем культивирования.

2.2.2. Изучение основных факторов, влияющих на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

Гибель клеток является основной проблемой при глубинном суспен­зионном культивировании в биореакторах. Гибель клеток в биореакторе, при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть объяснены влиянием аэрации с использованием барботажных устройств. Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количест­вом кислорода и углекислого газа. Влияние аэрации можно разделить на влияние са­мих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основ­ные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков при перемешивании, образовании поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырьков при диспер­гировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит и при образовании пены.

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защитной пленкой (поверхностно-активных веществ-ПАВ). В период образова­ния и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька.

До достижения критического положения взаимодействие клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток. Чем больше молекул ПАВ адсор­бируется пузырьком, тем насыщенней он становится и клетки могут далее быть адсор­бируемыми пузырьком не будут поврежденными. Адсорбированные клетки могут передвигаться по поверхности пузырька. Если пузырек полностью насыщен, то новые клетки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, где они могут затем погиб­нуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации F/V(F – скорость потока газа, V – рабочий объем биореактора), для пузырьков диаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты по барботированию, при которых варьировалось время пребывания пузырьков в куль­туральной жидкости, четко показали, что гибель клеток в биореакторе не всегда вызывается всплыванием пузырьков. Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость гибели клеток требует дальнейшего изучения. Хорошее защитное действие ПАВ от гидроди­намических напряжений сдвига при барботировании так же эффективно, как и при пе­ремешивании, предлагается в качестве основного метода и при масштабировании про­цесса выращивания клеточных культур в биореакторах.

2.2.3. Культивирование клеток сперматогоний

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного культивирования сперматогоний свиньи.

В первом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 5-106 кл/мл.

Культивирование во втором периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 109 кл/мл.

В третьем периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза жизнеспособных клеток составила 107 кл/мл.

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования сперматидов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованием биофильтра Sulzer с 1010 кл/мл до концентрации 5х1015 кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5. Концентрация сперматидов составила 5x1015 кл/мл.

Контролируемыми и регулируемыми параметрами явились: температура культивирования, скорость вращения мешалки, рН, еН, рО2, рСО2 и концентрация сперматогоний. Алгоритм управления приведен в табл. 3.

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе.

С целью создания трансгенных свиней оптимизированные параметры культивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая сперматогонии, несущие дополнительную информацию.

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионного культивирования клеток семенника поросенка в процессе сперматогенеза.

Таблица 3

Алгоритмы управления процессом суспензионного

культивирования сперматидов

Период сперматогенеза Параметр Уровень поддержания
Первый период Температура рН еН рО2 рСО2 35+0,5°С 7,0-7,1+0,01 -200мв+10% 40% нас. + 10% 5%нac. + 10%
Второй период Температура рН еН рО2 рСО2 35+0,5°С 7,2+0,01 -100мв+10% 40% нас. +10% 5%нас.+ 10%
Третий период Температура рН еН рО2 рСО2 35+0,5°С 7,1+0,01 -200мв+10% 60% нас. + 10% 7%нac.+ 10%
Четвертый период Температура рН еН рО2 рСО2 35+0,5°С 7,2+0,01 -200мв+10% 60%нас.+10% 7%нас.+ 10%




Кроме того, работы по оптимизации питательных сред на втором периоде и особенно на третьем и четвертом периодах сперматогенеза, осуществляемого нами способом суспензионного культивирования, являются более сложными и требуют дальнейшего изучения.

2.2.4. Культивирование и накопление вирусов бешенства, ИРТ, ПГ-3 при глубинном культивировании в биореакторах

При культивировании вирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства с использованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 в биореакторах по отработанным оптимальным параметрам в отделах вирусологии и молекулярной биологии в 2001-2004 гг. были получены данные, представленные в таблице 4.

Таблица 4

Результаты накопления вирусов при их культивировании

в биореакторах суспензионным способом

Культура клеток Вирус n Титр в
ИФА lg LD50/мл
ПТ-80 ИРТ 5 1:512 6,9+0,2
ПГ-3 5 1:563 7,4+0,1
ВНК 21/13 бешенства 7 1:512 6,3+0,2


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.