WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |

Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах россии

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Кочнева Галина Вадимовна

Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России

03.01.03 – молекулярная биология

03.02.02 – вирусология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово-2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научные консультанты член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, Сергей Викторович Нетесов
доктор биологических наук, профессор Валерий Борисович Локтев
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич
доктор биологических наук Мордвинов Вячеслав Алексеевич
доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна
Ведущая организация Учреждение российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Защита состоится « 24 » декабря 2010 г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «_____»________________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучению вопросов молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов в России долгое время уделялось мало внимания. Не было единого подхода в проведении эпидемиологических исследований, большинство результатов основывалось на данных официальной статистики, полученных без использования принятых в развитых странах и рекомендованных ВОЗ методов, таких как: подтверждающие серологические тесты и ПЦР анализ - в диагностике; филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей - в генотипировании образцов; использование программ EpiInfo и SPSS – для статистически значимой оценки факторов риска инфицирования вирусами гепатитов. Проведённые к 2001 году работы по молекулярной эпидемиологии гепатитов В, С и G были единичными в России и охватывали в основном население европейской части страны, тогда как популяции регионов, расположенных за Уралом, были изучены совершенно недостаточно. Крупномасштабных исследований по генотипированию HBV и HGV до публикации результатов наших работ в 2003 году в Российской Федерации не проводилось. В связи с вышесказанным в 2001г нами был начат цикл комплексных молекулярно-эпидемиологических исследований парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории трех сибирских регионов России – Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.

Знание особенностей молекулярной эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов на определенной территории имеет важное социальное значение и способствует разработке продуманной стратегии борьбы с этими инфекциями. Особое место в этой борьбе занимает вакцинопрофилактика. Среди исследованных нами трех парентеральных вирусных гепатитов B, C и G вакцина разработана только в случае HBV инфекции.

Для вакцинации против гепатита В в настоящее время повсеместно используется рекомбинантный поверхностный белок HBV (HBsAg), выделенный из культуры клеток дрожжей. Эффективность вакцинации определяется путем измерения концентрации анти-HBs IgG в сыворотке крови (протективный уровень >10 МЕ/л). Однако в течение 5-7 лет после полного курса прививок от 30 до 50 % лиц утрачивают антитела, что ставит вопрос о необходимости ревакцинации [Акимкин, 2004; Yuen et al., 2004]. Вместе с тем установлено, что вакцинация ведет к индукции эффективной и продолжительной иммунологической памяти, которая обеспечивает защиту от инфекции и после утраты антител [Селиашвили и др., 2006; Yuen et al., 2004], но этот критерий защищенности практически не исследован у вакцинированных против гепатита В. Методом его оценки может стать определение индекса HBsAg-специфической стимуляции лимфоцитов периферической крови в ELISPOT анализе.

Создание вакцины против гепатита С - одна из самых насущных задач мирового здравоохранения. Ее решение сдерживается рядом факторов, в числе которых высокий уровень изменчивости вируса. Наибольшая вариабельность наблюдается в поверхностных белках Е1 и Е2 HCV [Simmonds et al., 2005], однако антитела именно к этим белкам обладают вируснейтрализующей активностью [Yu et al., 2004]. В настоящее время идет накопление данных о том, какие районы поверхностных белков вируса гепатита С индуцируют синтез антител с широким спектром действия, способных нейтрализовать различные генотипы и субтипы вируса. Пептиды, имитирующие структуру таких районов, рассматриваются в качестве перспективных компонентов анти - HCV вакцин.



Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение комплексного молекулярно-эпидемиологического исследования парентеральных вирусных гепатитов на территории сибирских регионов России, а также оценка протективных свойств поверхностных белков вирусов гепатитов В и С.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1) Организация и проведение молекулярно-эпидемиологических исследований гепатитов В, С и G в Новосибирской, Иркутской областях и Алтайском крае:

  • постановка методов молекулярно-эпидемиологического анализа в соответствии с рекомендованными ВОЗ и принятыми в развитых странах стандартами (http://www.who.int/chp/steps);
  • анализ сывороток крови с обязательным использованием двух типов ИФА – скринингового и подтверждающего;
  • генотипирование изолятов HBV, HCV и HGV с использованием наиболее репрезентативных районов вирусного генома;
  • создание баз данных в формате EpiInfo, включающее перенос информации со всех бумажных и инструментальных носителей – результаты анкетирования, ИФА, ПЦР и генотипирования изолятов; данные выписки из истории болезни в случае пациентов стационаров - в структурированный электронный формат;
  • выявление статистически значимых факторов риска инфицирования HBV, HCV и HGV.

2) Оценка напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета методом ELISPOT через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В:

  • формирование группы участников исследования из сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», вакцинированных против вирусного гепатита В как группы риска инфицирования;
  • выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix;
  • оценка применяемой схемы вакцинации и ревакцинации против гепатита В на основе полученных данных.

3) Сравнительный функциональный анализ антител, индуцированных нативными (у инфицированных людей) и рекомбинантными (у иммунизированных мышей) гликопротеинами Е1 и Е2 вируса гепатита С:

  • пептидное сканирование антигенного профиля нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV и выявление межгенотиповых различий;
  • получение рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV в клетках млекопитающих с помощью двух экспрессирующих систем – вирусов Синдбис и осповакцины, сравнение их иммунохимических свойств и антигенного профиля;
  • картирование вируснейтрализующих линейных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV и оценка их перекрестной активности.

Научная новизна. В данной работе в соответствии с международными стандартами впервые проведено крупномасштабное молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов В, С и G на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края.

Созданы три уникальные электронные базы данных в формате EpiInfo, содержащие эпиданамнез и результаты иммуно- и генодиагностики гепатитов В, С и G среди 5605 представителей разных групп населения Сибирского региона России. В исследование были вовлечены пациенты инфекционных больниц и наркологической клиники; медицинские работники ряда крупных городских и сельских больниц; группы, сформированные по принципу места проживания или места работы.

Впервые получены данные по встречаемости маркеров HBV, HCV и HGV среди представителей разных групп населения трех регионов Сибири. Оценена роль HBV и HCV в этиологии острых и хронических гепатитов на обследованной территории.

С использованием созданных электронных баз данных и статистических мощностей программы EpiInfo-2007 впервые проведена количественная оценка факторов риска инфицирования гепатитами В, С и G в период с 2001 по 2003 гг. Силу статистической связи между каждым фактором риска и статусом по инфекции выражали с помощью отношения шансов (OR, odds ratio).

Впервые проведен анализ генотипического разнообразия сибирских изолятов HBV и HGV, а в случае HCV показано, что встречаемость генотипов существенно различается в разных возрастных и популяционных группах.

Получены новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В. Показано, что клеточное звено вносит существенный вклад в развитие поствакцинального иммунного ответа.

С использованием панели из 76-ти перекрывающихся синтетических пептидов впервые проведен сравнительный полноразмерный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита C трех генотипов 1b, 2a/2c и 3а. Показано, что общие для всех генотипов HCV высокоиммуногенные пептидные эпитопы белков Е1 и Е2 расположены в позициях аминокислот 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440 и 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. В районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена новая антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с генотипа HCV.

С использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 и культуры клеток гепатомы человека Huh-7.5 выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1 белок) и 496-515 (Е2 белок), первый из которых является генотип-специфическим, а второй – консервативным.





В рамках работы по созданию белковых вакцин против гепатита C был проведен сравнительный анализ двух эукариотических систем экспрессии генов поверхностных гликопротеинов HCV с целью получения белков, наиболее адекватных природным аналогам. Впервые показано, что в одних и тех же клетках млекопитающих (BHK-F) рекомбинантные белки Е1 и Е2 HCV, полученные в системе экспрессии вируса осповакцины (VV), существенно отличаются от аналогичных белков, полученных в системе вируса Синдбис (SIN). Хотя оба препарата белков индуцируют синтез антител к поверхностным гликопротеинам HCV, иммунный ответ к VV-экспрессированным белкам был выше и обладал большей универсальностью в отношении разных генотипов HCV, чем иммунный ответ к SIN-экспрессированным белкам.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного крупномасштабного молекулярно-эпидемиологического исследования получены статистически значимые количественные оценки дифференцированной встречаемости маркёров парентеральных вирусных гепатитов в различных популяционных группах, заболеваемости острыми и хроническими формами гепатитов, факторов риска и параметров интенсивности циркуляции генотипов HBV, HCV и HGV в период 2001-2003 гг на территории Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края. Результаты исследований были доведены до сведения региональных медицинских служб и главных врачей крупных инфекционных больниц и использовались ими для разработки стратегии борьбы с распространением вирусных гепатитов в регионах Сибири.

В связи с тем, что общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и С+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков, оценки путей заражения и распространения разных типов психотропных препаратов оказались полезны при проведении адресных превентивных программ в сфере контроля за оборотом наркотиков.

Созданные электронные базы данных представляют отдельную как научную, так и практическую ценность. Они могут использоваться для комплексной динамической оценки ситуации по вирусным гепатитам в исследованных регионах России в любом временном периоде.

Показана важность проведения ПЦР-анализа для диагностики наиболее распространенных вирусных гепатитов в случаях наличия клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры.

Полученные новые данные по оценке состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В позволили предложить ряд рекомендаций по проведению ревакцинации в гетерогенных по возрасту, состоянию здоровья, привычкам и степени опасности группах риска инфицирования HBV.

Проведенный сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV показал, что иммунохимические свойства этих белков могут существенно зависеть от системы экспрессии. Причем эффективность продукции, на которую, обычно, исследователи обращают внимание в первую очередь, может быть одинаковой, а свойства белков разные. Данный факт необходимо учитывать при планировании экспериментальных работ с аналогичными мембран-связанными гликозилированными белками.

Картирование позиций высокоиммуногенных линейных эпитопов поверхностных белков Е1 и Е2 сибирских изолятов HCV может быть использовано для совершенствования региональной диагностики гепатита С.

Пептиды, соответствующие новым вируснейтрализующим линейным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.

Положения, выносимые на защиту:

1. Внутривенное употребление наркотиков является основной причиной заболеваемости парентеральным вирусным гепатитом С (OR=27.3) и смешанной инфекцией HCV и HBV (OR=10.0) на территории сибирских регионов России в период 2001-2002 гг. Вторым по значимости фактором риска являются инвазивные медицинские процедуры, наибольшую опасность из которых представляет переливание крови (OR=3.8–11.3). Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV является статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах (OR=1.66-2.88).

2. При наличии клинических проявлений гепатита и отрицательных результатах ИФА на известные вирусные маркеры необходимо проведение ПЦР-анализа для выявления геномов наиболее распространенных вирусных гепатитов. Такой подход позволяет дополнительно диагностировать 32.7% случаев острого гепатита и 78.9% случаев хронического гепатита в группах «безмаркерных» пациентов.

3. С увеличением возраста респондентов, инфицированных HCV, растет доля генотипа 1 и снижается доля генотипа 3. Этот сдвиг обусловлен миграцией генотипа 3 HCV из районов производства наркотиков. Около 90% лиц, употребляющих наркотики, попадает в возрастную группу до 35 лет.

4. Генотипирование изолятов HCV (n=818) по двум противоположным районам генома 5’-UTR и NS5В выявило четыре рекомбинантных изолята с генотипами 2k/1b (2) и 2a-2c/1b (2), что ранее являлось крайне редким явлением вследствие генотипирования только по одному району генома – 5’-UTR.

5. Через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В в группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (<10МЕ\л), положительный индекс HBsAg стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев, что достоверно выше (p < 0.05), чем в группе с протективным уровнем анти-HBs IgG (48.1%). Это свидетельствует о важности оценки клеточной составляющей иммунитета при разработке стратегии вакцинации и ревакцинации.

6. Полноразмерное пептидное сканирование антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 выявило существенные различия, характерные для сибирских изолятов 1b, 2a/2c и 3a генотипов HCV. Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. Этот факт необходимо учитывать при разработке вакцин против гепатита С.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.