WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (nicotiana tabacum l.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы генетика –

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Колодяжная Янина Станиславна

Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

Генетика – 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2007

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель Кандидат биологических наук, доцент Кочетов Алексей Владимирович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Дорогина Ольга Викторовна, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН Кандидат биологических наук Ибрагимова Салмаз Саидовна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

Защита состоится 25 апреля 2007 г. на _______________ заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333 12 78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан 21 марта 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук А.Д.Груздев

Введение

Актуальность проблемы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая или низкая температура, недостаток влаги, недостаток кислорода, высокая щелочность или кислотность почвы, оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Одним из существенных факторов, ограничивающих выращивание сельскохозяйственных растений во многих агроклиматических зонах, является засоление почв. Избыточные концентрации соли вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсический эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005). В частности, при стрессовом воздействии на растения в клетках начинают синтезироваться белки, участвующие в транскрипционном контроле, белки теплового шока, осмопротектанты (аккумулируются пролин, бетаины, полиамины и т.д.), что обеспечивает нормальное протекание клеточных процессов (Kuznetsov et al., 1993; Кузнецов, Шевякова, 1999; Баранова и др., 2006).

В последнее время для придания растениям полезных признаков в процессе выведения новых сортов для различных зон возделывания широко применяются достижения генетики и молекулярной биологии. Одно из таких достижений – получение методами генной инженерии растений, устойчивых к различным неблагоприятным факторам окружающей среды. Современный этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". К задачам этой отрасли биотехнологии можно отнести создание растений, накапливающих осмолиты (например, пролин), которые способствуют поддержанию тургора клеток, нейтрализующих радикалы и т.д. В работах многих авторов показана положительная связь между уровнем накопления пролина и стрессоустойчивостью растений (Сохансандж и др., 1997; Кузнецов, Шевякова, 1999), однако, роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса изучена недостаточно. В частности, это касается взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью: исследования, проведенные на растениях арабидопсиса с супрессированным геном пролиндегидрогеназы (ПДГ), дали противоречивые результаты (Nanjo et al., 1999; Mani et al., 2002).

Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между метаболизмом пролина и устойчивостью к различным видам абиотических стрессов на модели генетически модифицированных (ГМ) растений табака. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получить линии ГМ растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) и характеризующиеся повышенным содержанием пролина.

2. Изучить наследование генетической конструкции в потомствах генетически модифицированных растений, полученных от самоопыления растений трансформантов.

3. Проанализировать устойчивость ГМ и контрольных растений к следующим стрессовым факторам: засолению, токсичным аналогам пролина, осмотическому стрессу, воздействию высоких температур, повышенным концентрациям тяжелых металлов

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые получены линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Впервые показана повышенная устойчивость полученных ГМ растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов: засолению, присутствию токсичных аналогов пролина, к токсическим концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для современной биотехнологии и селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным средовым воздействиям. Полученные ГМ растения табака можно использовать в качестве модели для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости. Разработанный подход также можно рекомендовать для получения сортов хозяйственно-ценных растений, характеризующихся повышенной комплексной устойчивостью к различным абиотическим стрессам.



Положения, выносимые на защиту.

  1. Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, характеризуются увеличенным содержанием пролина (до пятого поколения от самоопыления включительно).
  2. Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются повышенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов (засолению, токсическим концентрациям тяжелых металлов, осмотическому стрессу, воздействию засухи, повышенных температур)

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе–конференции молодых ученых, 2003; конференции МОГИС, 2003; Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003; Съезде ВОГиС, Москва, 2004; III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах, включает 19 рисунков и фотографий, 15 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 206 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение трансгенных растений табака. Для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. в качестве исходного материала был взят сорт табака SR1. Использованная для трансформации табака генетическая конструкция, содержащая участок гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации, была получена сотрудником лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики С.Е. Титовым (Кочетов и др., 2004). Трансформация растений табака проведена путем кокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens (штаммы LBA4404 или PGV3850). Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина, 200 мг/л). В результате самоопыления были получены линии ГМ растений табака, характеризующиеся повышенным уровнем пролина и устойчивостью к канамицину.

Анализ наследования встроенных генов. Оценку наследования встроенной конструкции у потомств ГМ растений, полученных в результате самоопыления, проводили, оценивая соотношение зеленых и хлоротичных (неустойчивых к канамицину) проростков.

Оценка содержания свободного пролина. Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса (Bates et al., 1973). Измерения проводили на растениях в возрасте 4-5 недель, культивируемых при температуре 23-250С и 16-часовом световом дне.

Исследование солеустойчивости. Для оценки были взяты растения на разных стадиях развития (семена и проростки, выращенные в нормальных условиях до стадии двух пар настоящих листьев), которые помещались на среду MS с различным содержанием NaCl (в разных опытах - 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 мМ).

Оценка уровня оводненности растений. Оводненность изучали на растениях, выращенных на среде MS (контроль) и на MS с добавлением 200 и 300 мМ NaCl. Через 4-5 недель культивирования надземные части растений взвешивали (сырая масса); для определения сухой массы растений проводили их высушивание при 700С в течение суток.

Оценка устойчивости к токсичным аналогам пролина. Исследования проводили на среде MS с добавлением 0.1 мМ L-азетидин-2-карбоксиловой кислоты. Оценивали рост и развитие проростков на данной среде, размер семенных коробочек и число семян, сформированных после пересадки растений в теплицу. Для оценки устойчивости ГМ растений к другому аналогу пролина – тиапролину - в среду MS его добавляли в концентрации 0.1, 0.3 и 0.5 мМ. Реакцию растений оценивали по внешнему виду и по массе растений через месяц после начала культивирования.

Оценка устойчивости к повышенному содержанию солей тяжелых металлов. Семена ГМ линий и нетрансгенного сорта SR1 высевали на среду МS (контроль) и на среду МS с добавлением хлорида кадмия (0.1 мМ; 0.2 мМ), нитрата свинца (0.1 мМ; 0.3 мМ), сернокислого никеля (0.1 мМ; 0.2 мМ; 0.4 мМ) или хлорида ртути (0.05 мМ; 0.1 мМ). На этих средах в условиях климатокамеры (+210С, 16-часовой световой день) растения выращивали в течение 2 месяцев.





Определение концентрации хлорофиллов a и b. Экстракцию пигментов проводили 96%-ным этиловым спиртом; в полученных растворах количественное содержание пигментов оценивали спектрофотометрическим методом (Шлык, 1971).

Оценка повреждаемости мембран в условиях осмотического стресса. Барьерные свойства мембран определяли по степени выхода электролитов после осмотического шока (применяли 40%-й раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000). Для исследований целостности мембран использовали методику, основанную на измерении электропроводности водного раствора, содержащего листовые диски, подвергавшиеся осмотическому стрессу (погружение дисков в 40% раствор ПЭГ-6000, осмотический потенциал этого раствора составлял –4,0 МПа при 210С) (Riga и Vartanian, 1999).

Всхожесть семян в условиях осмотического стресса. Семена помещали на влажную фильтровальную бумагу, смоченную 1%-м раствором ПЭГ-6000 (опыт). В качестве контроля те же образцы помещали на фильтровальную бумагу, смоченную водой. Подсчет всходов проводили на 21 день после культивирования при 250С. Также были оценены размеры проростков.

Влияние высоких температур на всхожесть семян. Была проведена оценка всхожести семян после экспозиции в течение 1, 2, 3, 4, 5 суток при температуре 37°С. Для проведения анализа семена предварительно замачивали на сутки, а подсчет проростков (оценку всхожести) проводили на 10 сутки после посева.

Определение активности пролиндегидрогеназы. Активность фермента пролиндегидрогеназы оценивали по методу Маттиони (Mattioni et al.,1997).

Статистические методы. Для статистической оценки экспериментальных наблюдений использовали следующие статистические критерии: t – критерий Стьюдента для сравнения средних арифметических значений малых выборок; U – критерий Фишера (для сравнения долей, выраженных в процентах) (Урбах, 1964) и G – критерий для дискретных признаков (описание сегрегации Т-ДНК инсерций в потомствах ГМ растений табака) (Sokal, Rohlf, 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение линий ГМ растений табака Nicotiana tabacum L., несущих супрессор гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации.

Вследствие экспрессии антисмыслового супрессора гена ПДГ у полученных трансформантов был отмечен повышенный уровень свободного пролина (таблица 1). Согласно полученным данным, содержание пролина у ГМ растений этого возраста оказалось в среднем в 1.5-2.5 раза выше, чем у контрольных растений сорта SR1. Содержание пролина в тканях растений относится к высоковариабельным признакам и определяется множеством параметров (уровнем освещенности, временем суток, возрастом растений, температурным режимом и т.д.), что отмечают также другие авторы (Kishor et al., 1995; Sheveleva et al., 1997; Zhu et al., 1998).

Таблица 1. Среднее содержание пролина у потомков трансформантов (поколение Т1)

Трансфор-манты Содержание пролина, мкг/г веса Сравнение по содержанию пролина с нетрансгенным контролем, %* Значение критерия t (опыт/ контроль), t0,99=2,7
1 1722 ± 693 248 1.53
2 1348 ± 124 208 4.5**
3 855 ± 227 132 0.84
5 1294 ± 126 200 4.17**
6 1115 ± 297 172 1.50
8 864 ± 306 133 0.67
10 1509 ± 839 233 1.02
Контроль* 648± 94 100


Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.