WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством ассоциированной паротитно-коревой вакцины

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Колышкин Владимир Михайлович

Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством ассоциированной паротитно-коревой вакцины

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и в Московском подразделении по производству бактерийных препаратов (МПБП) ФГУП научно-производственного объединения «МИКРОГЕН» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный консультант: Доктор биологических наук, доцент

Васильев Алексей Васильевич

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор Белоусова Раиса Васильевна;

2. Доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович;

3. Доктор биологических наук, профессор Тихонова Нина Тимофеевна.

Ведущая организация: Государственное Учреждение НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится « » __________ 2010 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина.

Автореферат разослан «____ » _______ 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Борьба с инфекционными болезнями, составляющими 60-70% общей патологии человека, является важнейшей задачей современной медицины. Система мер профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями многообразна, но ведущее место в ней принадлежит вакцинации (В.Ф. Учайкин, 2001, Н.В. Медуницын, 2004). Именно с прививками связаны достигнутые в борьбе с инфекциями успехи, на них строятся и перспективы ликвидации некоторых из них. Иммунопрофилактика получила широкое распространение в мировой медицинской и ветеринарной практике. Так, ежегодно в мире вакцинируется около 1,5 млрд. человек, что составляет около 1/4 населения планеты (Г.Г. Онищенко, 2006) и до 70 % поголовья животных (И.А. Бакулов, 1998). В РФ вакцинация взята под контроль Государства (Федеральный Закон от 17 сентября 1998г. № 157-ФЗ "Об иммунопрофилактике инфекционных болезней", Приказ от 27.06.2001 № 229 МЗ РФ).

Стратегия и тактика вакцинопрофилактики вирусных инфекций затруднена в ряде случаев из-за перегруженности календаря прививок. Одним из радикальных решений данной проблемы является разработка и рациональное использование вместо моно препаратов ассоциированных вакцин, применение которых имеет несомненные преимущества в плане сокращения количества инъекций, снижения уровня аллергизации населения, создания напряженного иммунитета одновременно к нескольким инфекциям (Б.Ф.Семенов 2003, В.В.Зверев, 2005).

При разработке и апробации ассоциированных вакцин предварительно оцениваются совместимость и оптимальное соотношение исходных антигенов, дозы и схемы вакцинации и ревакцина­ции, а также клинико-иммунологическое обоснование возможности и эффективности применения препаратов. Каждая новая разработка ассоциированных вакцин оценивается с учетом указанных требований (Попов В.Ф., 2002).

Важность проблемы стабильного производства иммунобиологических препаратов, используемых для выполнения Национального календаря профилактических прививок, связана с тем, что Всемирная Организация Здравоохранения поставила перед национальными органами здравоохранения задачу ликвидации заболеваемости корью и резкого снижения заболеваемости эпидемическим паротитом в мире к 2010 году (Бектемиров Т.А., 2002).

В настоящей работе приведены материалы исследований по разработке технологии производства ассоциированной вакцины против кори и эпидемического паротита (АПКВ), созданию и внедрению системы управления качеством, включая анализ стабильности производства вакцинных препаратов с помощью статистических методов управления качеством.

Цель и задачи исследований:

Целью настоящей работы явилась разработка технологии промышленного производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины, изучение безопасности и эффективности нового вакцинного препарата и внедрение его в практику. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить пригодность вакцинного штамма эпидемического паротита Ленинград-3 (Л-3) для включения его в АПКВ.

2. Создать систему управления качеством и проведения анализа технологических процессов производства препаратов, изготавливаемых на предприятии в соответствии с требованиями стандартов надлежащей производственной практики GMP.

3. Провести оценку стабильности промышленного производства моновакцин для создания ассоциированного препарата.

4. Разработать методы контроля и мониторинга, позволяющие получить доказательства стабильности производства монопрепаратов.



5. Создать промышленную технологию производства АПКВ, провести производственные испытания в соответствии с требованиями программы, утвержденной ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ГИСК).

6. Провести оценку стабильности производства АПКВ с использованием современных специализированных программных пакетов по статистической обработке и анализу данных производственно-технологических процессов.

7. Разработать и утвердить нормативную документацию на производство АПКВ.

8. Оценить эпидемиологическую эффективность применения АПКВ по разработанной технологии в медицинской практике.

9. Оценить экономическую эффективность внедрения новой технологии производства АПКВ.

Научная новизна:

1. Впервые на основе существующей аппаратурно-технологической базы создано промышленное производство АПКВ, для обеспечения потребности РФ в средствах защиты от кори и эпидемического паротита.

2. На основе созданной производственной базы осуществляется выпуск АПКВ для обеспечения национального календаря профилактических прививок (Приказ от 27.06.2001 № 229 МЗ РФ).

3. Разработаны методы контроля клеточных линий, используемых для производства АПКВ. Внедрена система управления качеством при производстве монопрепаратов и АПКВ.

4. Проведена оценка эпидемиологической эффективности АПКВ в условиях массового применения (более 20 млн. доз, 2001-2009 г.г.)

Научно – практическая новизна результатов работы подтверждена получением патентов:

- Патент РФ на изобретение № 2158134 от 27.10.2000г. «Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины». Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В.

- Евразийский патент № 002387 от 25.04.02г. «Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины». Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В.

Практическая значимость и внедрение результатов научных исследований в производство:

1. Ассоциированная вакцина, производимая по разработанной технологии, используется для профилактики кори и паротита у детей соответствующих возрастов.

2. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация (НД) на производство АПКВ.

3. Вакцина АПКВ включена в Национальный календарь профилактических прививок РФ.

4. На предприятии-изготовителе действует система управления качеством в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52249-2004.

5. Результаты научных исследований по разработке технологии приготовления АПКВ используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на:

- Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы». (СПб., 2003 г);

- I-ом Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству. (Москва, 2005 г.);

- IX - XV Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф 2001-2007);

- VIII, IX съездах Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. (Москва, 2006,2007 г.г.);

- Российском симпозиуме с международным участием «БИОФАРМА-2009». (Анталия, 2009 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 296 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 155 источника (83 отечественных и 72 зарубежных) авторов и приложения на 25 листах. Работа иллюстрирована 197 рисунками и содержит 57 таблиц.

Публикации

Основные научные результаты по материалам, изложенным в диссертации, опубликованы в 62 работах, из них в рецензируемых научных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 15 работ, получено 2 патента.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Впервые созданная технология промышленного производства АПКВ на основе аттенуированных вакцинных штаммов вируса эпидемического паротита Л-3 и кори Л-16, позволяет обеспечить выпуск препарата в требуемых объемах для проведения профилактических мероприятий.

2. Критерии оценки пригодности клеточных систем культивирования и контроля, позволяющие осуществлять стабильное промышленное производство вакцин надлежащего качества с полноценными иммунобиологическими свойствами, обеспечивающее безопасное и эффективное применение.

3. Разработанная система управления качеством, включающая контроль сырья, материалов, полуфабрикатов, готовой продукции, мониторинг показателей технологических процессов при производстве АПКВ позволяет получить объективную оценку качества продукции.

4. В результате созданной технологии производства и системы управления качеством в период с 2001 года по настоящее время выпущено более 20 млн. доз АПКВ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Для создания ассоциированной паротитно-коревой вакцины использовали вакцинные штаммы, применяемые для изготовления моновакцин: Ленинград -16 (Л-16) вируса кори; Ленинград - 3 (Л-3) вируса эпидемического паротита. Их культивировали в первично-трипсинизированных фибробластах эмбрионов японского перепела. Перепелиные яйца и перепелиные эмбрионы соответствовали требованиям ФСП 42-01450431- 00 «Эмбрионы японского перепела для производства вирусных вакцин».





Процесс изготовления АПКВ включает получение вируссодержащей жидкости (ВСЖ) кори и эпидемического паротита, сведение их с защитной средой (получение жидкого полуфабриката), с последующим объединением жидких полуфабрикатов. Стабильный выпуск моновакцин против кори и эпидемического паротита надлежащего качества позволил разработать новую оригинальную технологию производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины.

Из эмбрионов перепелов за один производственный цикл готовят клетки для засева 24 роллерных культуральных флаконов, 20 из которых заражают вакцинным вирусом кори, штамм Л-16, в дозе от 0.01 до 0.001 ТЦД50 на клетку и инкубируют при температуре 36±0,2о С, 4 флакона оставляют контрольными. Из 20 зараженных роллерных флаконов получают около 6 литров вируссодержащей жидкости 1-4 сливов. Каждый полученный слив в объеме около 0,3 л контролируют на отсутствие контаминантов и определяют величину специфической активности титрованием в культуре клеток Vero.

Состояние перевиваемых линий клеток контролировали с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитофлуориметра EPICS-5 (Coulter Electronics, США). Учет специфической активности вируса проводили по цитопатическому действию вируса и рассчитывали по методу Reed L.J., Muench H.A., (1938).

Не содержащие контаминантов жидкие полуфабрикаты, полученные за один технологический цикл, со специфической активностью более 4,2 lg ТЦД50/0,5 мл хранят при температуре минус 50-56оС в течение необходимого времени, затем размораживают, повторно титруют, сводят в один пул и используют для сведения с полуфабрикатом вакцины против эпидемического паротита.

Технология производства паротитной моновакцины очень близка к технологии производства коревой вакцины и различается в деталях. В соответствии с регламентом и ФС 42-0038-00 «Вакцина паротитная культуральная живая сухая» производится из отечественного штамма Л – 3. Отличия в технологии изготовления паротитной вакцины касаются дозы заражения, времени съема и количества сливов. Контроль над качеством титрования вирусных сборов проводится с помощью отраслевого стандартного образца (ОСО) вакцинного вируса эпидемического паротита.

Главным достижением в технологии производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины является разработка способа сведения полуфабрикатов кори и эпидемического паротита, обеспечивающего в сухом препарате преобладание паротитного компонента над коревым приблизительно на 1 lg.

Жидкие полуфабрикаты кори и эпидемического паротита, являющиеся полуфабрикатами для моновакцин, сводят в определенном соотношении, как указано в патенте, тщательно перемешивают, разливают в ампулы и лиофилизируют.

Одна прививочная доза АПКВ содержит:

  • не менее 1000 ТЦД50 - 3 lg тканевых цитопатогенных доз (ТЦД50/0.5 мл) вируса кори;
  • не менее 20 000 ТЦД50 - 4. 3 lg ТЦД50/0.5 мл вируса эпидемического паротита;
  • антибиотик - гентамицина сульфат не более 25 мкг;
  • стабилизатор – смесь ЛС-18 - 0,08 мл., и 0,002 г. желатина.

С целью стандартизации процесса титрования обоих вирусов на предприятии создан банк перевиваемых культур клеток, который аттестован ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

С целью управления производством с использованием процессного подхода на основе реальной информации, на предприятии создана система обеспечения качества в соответствии с требованиями стандартов ИСО серии 9000 (Колышкин В.М., 2004).

Стабильность производства компонентов и готового продукта АПКВ изучали с использованием статистических методов (Митрохин И.Н., Орлов А.И., 2007; Орлов А.И., 1997). Анализу подвергали записи маршрутных листов технологического процесса получения коревой и паротитной вакцин, имеющиеся на предприятии в электронном виде.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Учитывая, что технология создания суммирует технологии создания коревой и паротитной моновакцин, нами рассмотрены вопросы создания моновакцин, а затем приведены данные по готовому продукту - ассоциированной паротитно-коревой вакцине.

Характеристика универсального субстрата для промышленного производства полуфабрикатов коревой и паротитной вакцин.

Фибробласты перепелов являются единым субстратом для производства вакцин против кори и эпидемического паротита. Все операции по получению культуры регистрировали в разработанных маршрутных картах. Эффективность и стабильность процесса трипсинизации оценивали по выходу клеток на 1 г. ткани. В табл. № 1, 2 приведены результаты оценки выхода клеток в период с 2002 по 2005 годы на участках по производству коревой и паротитной вакцин.

Таблица № 1

Анализ данных по выходу клеток на участке по производству коревой вакцины за 2002-2005 г.г.

Год

Количество колб

Выход клеток 106/г.

Мин.

Макс.

Размах

С v %

2002

19

65,3±5,0

55,7

72,2



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.