WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Характеристика биологических свойств бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ

ВИБРИОНОВ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону

2013

Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Кудрякова Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится «____» ____ 2013 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

Автореферат разослан «____» _________ 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного cовета

доктор социологических наук,

доцент Ковалева Марина Дмитриевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Продолжающаяся седьмая пандемия холеры привлекла пристальное внимание исследователей к проблеме патогенных для человека вибрионов. Вспышка холеры, обусловленная холерными вибрионами О139 серогруппы, сходство этого возбудителя с вибрионами эльтор объясняют повышенное внимание исследователей к новому эпидемическому фактору холеры (Москвитина Э.А. с соавт. 2011; Иванова С.М. с соавт., 2011). Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных вибрионов, а их присутствие в клетках бактерий приводит к появлению новых свойств (Остроумова Н.М. с соавт., 1971; Милютин В.Н. с соавт., 1980; Остроумова Н.М. с соавт., 1993; Смирнова Н.И. с соавт., 1999; Щелканова Е.Ю. с соавт., 2001; Ерошенко Г.А. с соавт., 2000, 2003; Ильина Т.С., 2003; Davis B.M. et al., 2003). Детальное изучение механизмов взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение (Сомова А.Г., 1968; Дрожевкина М.С., 1974; Остроумова Н.М. с соавт., 1986; Кудрякова Т.А. с соавт., 2003; Faruque S.M. et al., 2003, 2005). Актуальность проблемы заключается в выявлении общих закономерностей строения биологических структур бактериофагов, которые затем используют для их определения и классификации.

Наиболее важным этапом в лабораторной диагностике патогенных вибрионов является их выделение и идентификация (Ломов Ю.М. и др., 1994; Данилкина Е.Б., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»).

В настоящее время из фагов патогенных вибрионов наиболее изучены холерные бактериофаги, которые широко используются для диагностики и дифференциации возбудителя холеры (Быстрый Н.Ф., 1974; Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И., 1979; Кудрякова Т.А. с соавт., 2000; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Саяпина Л.В. с соавт., 2001; Безсмертный В.Е. с соавт., 2005; Ломов Ю.М. с соавт., 2008;).

Вместе с тем, сохраняет свою актуальность фагодиагностика V. cholerae O139 серогруппы «Бенгал», так как диагностические фаги холерных вибрионов непригодны для идентификации этого вида возбудителя.

Кроме того, недостаточно разработано применение бактериофагов в лабораторной диагностике парагемолитических вибрионов. Крупные вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванные этими вибрионами, были зарегистрированы в 1990-2000 годах в г. Владивостоке, в странах Юго-Восточной Азии, США, Канаде, Перу (Маслов Д.В., 1997; Wong H.C. et al. 2000; Williams T.L. et al., 2004; Nair G.B. et al., 2007; Boyd F., Fidelma et al., 2008).

В последние годы накопились сведения о фагах парагемолитических и альгинолитических вибрионов ( Кудрякова Т.А. и др., 2002, 2003; Chang B. et. al., 1998, 2002; Nasu H. et al., 2000; Tetsuya I. et al., 2001). Создана схема фаготипирования парагемолитических вибрионов (Кудрякова Т.А. и др., 1993; Хайтович А.Б. и др., 1997; Гальцева Г.В. и др., 1997). Однако фаготипирование парагемолитических вибрионов показало распространение вибрионов, дающих типы литических реакций, не укладывающихся в существующую схему фаготипирования, в связи с чем необходимо её совершенствование. Для первичной идентификации различных по морфологической структуре фагов необходимо иметь набор фагочувствительных штаммов.

До настоящего времени остается нерешенной проблема идентификации и дифференциации большой группы бактериофагов патогенных для человека вибрионов (V. cholerae и V. parahaemolyticus). Вместе с тем, для исследовательских целей и решения прикладных задач важно учитывать признаки бактериофагов, позволяющие выявить сходство и различия между ними.

Наличие в Центре по патогенным вибрионам ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора представителей различных видов вибрионов сделало реальным проведение среди них поиска продуцентов ранее неизвестных фагов.



Цель работы. Совершенствование идентификации бактериофагов и их применение для внутривидовой дифференциации холерных и парагемолитических вибрионов.

Задачи исследования

  1. Выделение бактериофагов из лизогенных штаммов холерных и других патогенных вибрионов.
  2. Расширение набора индикаторных штаммов патогенных вибрионов (холерных, парагемолитических) для обнаружения бактериофагов различных морфологических групп.
  3. Характеристика биологических свойств бактериофагов патогенных видов вибрионов.
  4. Дифференциация штаммов V. cholerae O139 серогруппы фаговым методом.
  5. Усовершенствование схемы фаготипирования V. parahaemolyticus.
  6. Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов.

Научная новизна работы. Выявлены умеренные фаги у различных видов патогенных вибрионов (V. cholerae О1, О139 серогрупп, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. alginolyticus), и было проведено сравнение биологических свойств, что позволило использовать их для научных исследований и в диагностике возбудителей ОКИ.

Впервые разработана внутривидовая дифференциация штаммов холерных вибрионов О139 серогруппы путём прямого и непрямого фаготипирования. Получен патент на изобретение «Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae O139» (№ 2268942 от 27.01.2006 г.). Использование предлагаемого способа позволяет с помощью индикаторных штаммов КМ-199 и КМ-152 проводить фаготипирование V. cholerae О139 серогруппы, получая при этом дополнительные характеристики холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала. Впервые обнаружены бактериофаги V. mimicus по биологическим свойствам сходные с холерными фагами. Фаги V. mimicus были депонированы в ФКУЗ Ростовском-на-Дону противочумном институте Роспотребнадзора под № ФК-85 и № ФК-98.

Усовершенствована схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, что позволило определить среди них 10 фаготипов вместо 4-х известных ранее, и повысить эффективность типирования штаммов с 48,4 % до 92,6 %.

Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруппы (Патент №2290445 от 27.12.2006 г.).

Впервые разработана общая схема идентификации, позволяющая выявить существенные различия между фагами некоторых видов патогенных вибрионов. Дополнена коллекция охарактеризованных фагов и индикаторных штаммов патогенных вибрионов. Составлен 4 выпуск «Каталога бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов и иерсиний», который одобрен Ученым советом и утверждён директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (01.03.11 г., протокол №1) и опубликован в виде реферата в Информационном выпуске №24 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2011). Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» №2010620549 от 24.09.2010.

Теоретическая и практическая значимость. Новые сведения о свойствах большой группы бактериофагов различных видов патогенных вибрионов расширяют наши познания о биологическом разнообразии вирусов бактерий. Анализ полученных данных позволяет установить не только их общность как представителей единого семейства бактериофагов, но и различия, отражающие дивергенцию этих видов в процессе эволюции. Способность генетических элементов бактериофагов включаться в клетки бактерий делает их хорошей моделью для изучения геномной пластичности вибрионов. Диагностические бактериофаги пригодны для идентификации вибрионов, а также для изучения физиологических свойств и поверхностных структур фагочувствительных штаммов, установления биологической эффективности любого воздействия.

Так как своевременное определение вида бактериофага крайне важно при его выделении из материала от людей больных холерой, острыми токсикоинфекциями, гастроэнтеритами или из объектов окружающей среды, проведение исследования осуществляется с соблюдением следующих этапов:

- использование специфических индикаторных штаммов холерных вибрионов, пригодных для выделения холерных бактериофагов (V. eltor KM-199, V. cholerae O139 KM-152);

- использование системы индикаторных штаммов, позволяет проводить первичную идентификацию холерных бактериофагов;

- использование депонированных тест-штаммов V. parahaemolyticus КМ-97, КМ-184 для первичной дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы;

- использование единой комплексной схемы анализа биологических свойств вибриофагов.

Определён комплекс идентификационных и дифференцирующих признаков бактериофагов у следующих вибрионов – V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. metschnikovii. Отмеченные чёткие таксономические показатели, полученные при сравнительном изучении бактериофагов патогенных вибрионов, легли в разработанную нами схему идентификации и дифференциации, включающую признаки их отличия: а) характерная морфология бактериофагов в электронном микроскопе – определение морфогруппы; б) специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов; в) отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов; г) устойчивость, либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре.





Предложенный набор фагочувствительных штаммов V. cholerae О1 (ctx+tcp+, ctx-tcp+), V. cholerae O139 серогруппы (ctx+tcp+) для выделения холерных фагов при мониторинге окружающей среды на вибриофлору позволяет обнаруживать бактериофаги. Морфо- и серогруппы изолированных холерных фагов коррелируют с обнаруженными фагами в лизогенных штаммах холерных вибрионов эльтор, циркулирующими в реках в эпидемический сезон.

Впервые установлена особенность взаимодействия выделенных фагов V. mimicus с гетерологичным хозяином V. cholerae, проявляющаяся в литической реакции со штаммом V. cholerae О37 серогруппы. Разработан способ дифференциации фагов V. mimicus от холерных с помощью индикаторного штамма V. cholerae 13022-69 О37 серогруппы, что используется для их отличия от холерных фагов при исследовании проб воды на вибриофаги.

Предложен способ для внутривидовой дифференциации штаммов V. cholerae O139 серогруппы с применением фаговых методов.

Депонированы в ГКПБ ФКУЗ Российский противочумный институт “Микроб” Роспотребнадзора штамм-продуцент фага V. parahaemolyticus, индикаторный штамм V. parahaemolyticus. Депонированы в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора фаги: Phagum parahaemolyticus ФК-90 (67) – I морфогруппы, использующийся для дифференциации индикаторных штаммов Vibrio parahaemolyticus КМ-184 и КМ-97; Phagum parahaemolyticus ФК-104, выделенный из штамма серогруппы О5:К15 и Phagum parahaemolyticus ФК-105, выделенный из штамма серогруппы О3:К6, которые могут использоваться в генетических исследованиях.

Полученные результаты нашли отражение в «Методических рекомендациях по идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов», одобренных Ученым советом и утвержденные директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (23.03.04 г., протокол № 4) и опубликованных в виде реферата в Информационном выпуске №17 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2004).

Материалы по фаговым методам лабораторной диагностики заболеваний, обусловленных V. cholerae О1 и не О1 серогрупп, V. parahaemolyticus, представлены на курсах профессиональной переподготовки врачей и биологов по специальности «бактериология» и на курсах повышения квалификации. Внедрён в лабораторную практику метод дифференциации штаммов и бактериофагов парагемолитических вибрионов (ФКУЗ «Северо-Кавказская противочумная станция» Роспотребнадзора, акт внедрения от 12.01.2011 г.). Результаты фаговых методов идентификации музейных и свежевыделенных штаммов холерных и парагемолитических вибрионов используются для паспортизации штаммов холерных и парагемолитических вибрионов, хранящихся в Музее живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (акт внедрения от 19.10.11 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Система индикаторных штаммов (холерных и парагемолитических) позволяет осуществлять первичную идентификацию фагов патогенных вибрионов.

2. Усовершенствование схемы фаготипирования расширяет возможности фаготипирования парагемолитических вибрионов.

3. Применение бактериофагов, выделенных из штаммов V. cholerae O139 серогруппы «Бенгал», позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов V. cholerae O139 серогруппы.

4. Использование схемы идентификации для фагов патогенных вибрионов обеспечивает сравнительную оценку сходства и различий между фагами (V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus).

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 15 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2003-2005, 2008, 2010, 2011, 2012); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008 г.); X Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ», (Ставрополь, 2010 г.); IX и X Межвузовские конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2010, 2011 гг.); Научно-практическая школа-конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010, 2011 гг.); IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2012); Научно-практическая конференция Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2012).

Диссертационная работа выполнена в рамках завершенной государственной темы № 050-4-04 «Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных вибрионов» и темы № 103-4-08 «Фено- и генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности».

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.