WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Миняев Михаил Владимирович

Комплексное моделирование процесса измерения

биохимического потребления кислорода в жидких

инкубационных средах

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Тверь - 2007

Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор Ворончихина Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

кандидат биологических наук, доцент Карцова София Владимировна

Ведущая организация Тверская государственная

медицинская академия

Защита состоится 12 ноября 2007 г. в 1400 на заседании диссертационного совета К 212.263.01 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 а, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170000, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.

Автореферат разослан «___» _____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Костюк Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Молекулярный кислород является без преувеличения важнейшим метаболитом аэробного обмена, имеющим ключевое значение в энергообеспечении организма. Поэтому уровень и характер биохимического потребления кислорода обычно рассматривается как основной показатель метаболической активности тканей, клеток и субклеточных структур. Современные биохимические измерительные приборы, предназначенные для регистрации данного показателя, обладают вполне приемлемыми техническими характеристиками. Тем не менее реальные результаты измерения биохимического потребления кислорода, согласно литературным данным, отличаются неоправданно низкой воспроизводимостью: ошибка среднего, которая в биохимических исследованиях используется для характеристики разброса показаний, при измерении метаболического потребления кислорода обычно составляет порядка 12% от измеряемой величины (Горская И.А., 1988; Капитанов А.Б. и др., 1990; Меерсон Ф.З., 1995 и др.), а довольно часто (Schurek H.J. et a., 1990; Ortmann C., 2003; Suttner S. et a., 2004 и др.) достигает 30 и более процентов. В результате корректной оказывается только сравнительная интерпретация полученных данных.

Подобное несоответствие между характеристиками оборудования и точностью полученных с его помощью результатов объясняется тем, что изменение концентрации кислорода в инкубационной среде, фиксируемое прибором, зависит не только от биохимического потребления кислорода изучаемым объектом, но и от диффузионных потоков кислорода между средой инкубации и ее окружением (Миняев М.В. и др., 1996, 2001, 2005, 2006, 2007), которые по величине сравнимы, а зачастую и превышают биохимическое потребление. Поэтому задача по выявлению и изучению факторов, определяющих величину и направление этих потоков, является актуальной, так как ее решение позволило бы существенно повысить точность биохимических исследований, связанных с изучением аэробного метаболизма и, как следствие, осуществить строгий количественный подход к изучению его важнейших биохимических механизмов.

Решение данной задачи с использованием аэробных биологических объектов оказалось крайне затруднительным по ряду причин, основной из которых явилась невозможность определения действительного количества потребленного ими кислорода и, следовательно, расчета наиболее важной количественной характеристики метода - относительной погрешности. Поэтому возникла необходимость моделирования биохимического процесса потребления кислорода с привлечением устойчивой, простой, доступной и воспроизводимой химической модели, так как действительное количество кислорода, поглощенное моделью, в отличие от биологического объекта, может быть легко проконтролировано. Использование подобной модели позволяет определять важнейшие динамические характеристики существующего оборудования, а также значительно облегчает разработку новой специальной биохимической аппаратуры, предназначенной для изучения аэробного метаболизма, что также является весьма актуальным.

Целью исследования явилось выявление и изучение факторов, искажающих результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами в малых объемах жидких инкубационных сред, и разработка специальной биохимической аппаратуры и методических подходов, позволяющих устранить или учесть влияние данных факторов для существенного повышения точности такого рода измерений.

В задачи исследования входило:

1) разработать эталонную химическую модель, имитирующую биохимическое потребление кислорода в жидких инкубационных средах, позволяющую точно контролировать действительное количество поглощенного кислорода;

2) путем химического моделирования метаболического потребления кислорода выявить факторы, оказывающие наибольшее искажающее влияние на результаты измерения потребления кислорода в малых объемах жидких инкубационных сред;

3) разработать конструкцию измерительной системы на базе амперометрического кислородного датчика, обладающую низкой собственной кислородной емкостью и позволяющую легко изменять и точно контролировать площадь поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации.



4) изучить динамику пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду открытой измерительной ячейки при различной площади поверхности раздела фаз воздух-среда;

5) разработать метод учета количества кислорода, поступившего в среду инкубации из атмосферы за время проведения замера биохимического потребления кислорода, и вычисления соответствующей поправки к результату измерения;

6) изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и собственной кислородной емкости измерительной системы в ходе замера потребления кислорода моделью биологического объекта;

7) разработать метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы и ее количественного вклада в погрешность измерения для вычисления соответствующей поправки к результату измерения биохимического потребления кислорода.

Научная новизна полученных данных. Впервые проведено исследование, в котором, путем моделирования биохимического потребления кислорода аэробным биологическим объектом, было изучено влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения потребления кислорода, полученные с помощью закрытого амперометрического кислородного датчика. На основании полученных данных разработана специальная биохимическая аппаратура и комплексный методический подход, позволяющие кардинально повысить точность подобных измерений и в значительной мере устранить искажения характера регистрационных кривых биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах.

Основные положения, выносимые на защиту. Неучтенный кислород, поступающий в среду инкубации из атмосферы, способствует существенному занижению результатов измерения биохимического потребления кислорода в открытых измерительных системах. Предлагаемый в данной работе метод позволяет учесть поступивший из атмосферы кислород и, таким образом, снизить погрешность измерения до уровня, характерного для закрытых измерительных систем.

Существующие приборы, предназначенные для измерения концентрации растворенного кислорода, обладают собственной кислородной емкостью. Диффузионный обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью измерительной системы ведет к заметному искажению результатов измерения биохимического потребления кислорода. Предлагаемый в данной работе метод предоставляет возможность определения как самой кислородной емкости, так и ее количественного вклада в величину погрешности результата измерения потребления кислорода, что позволяет существенно повысить точность такого рода измерений.

Конструкции выпускаемых промышленностью электрохимических измерительных приборов, предназначенных для регистрации метаболического потребления кислорода, не позволяют в достаточной мере учесть влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения, чем обусловлена неоправданно высокая погрешность при их использовании в биохимических исследованиях. Предлагаемая в данной работе измерительная система дает возможность снизить погрешность динамического измерения биохимического потребления кислорода до уровня погрешностей используемого оборудования.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят определенный вклад в экспериментальную биохимию аэробного метаболизма, позволяя с иной точки зрения взглянуть на интерпретацию результатов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность отдифференцировать биохимические и физико-химические причины регистрируемых изменений измеряемой величины при изучении потребления кислорода биологическими объектами. Большинство из выявленных в работе закономерностей являются универсальными, то есть в той или иной мере присущими любым измерительным системам, предназначенным для изучения биохимического потребления кислорода, вне зависимости от принципа их действия. Поэтому предлагаемый комплекс методических подходов может быть использован с любым биохимическим оборудованием подобного назначения, как существующим, так и перспективным.

Предложенный в работе подход к корректировке результатов измерения позволяет существенно повысить точность методов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность обратиться к изучению тонких биохимических механизмов аэробного метаболизма, а также к исследованию биологических объектов, характеризующихся низким потреблением кислорода. Результаты исследования позволяют систематизировать подходы к выбору существующих и конструированию новых электрохимических датчиков и ячеек, предназначенных для биохимических и биоэнергетических исследований.

Разработанное оборудование, методы и полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре биомедицины Тверского государственного университета: в курсе лекций, большом практикуме, а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета ТвГУ в 1995, 1998, 1999, 2000 и 2003 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей.





Структура и объем диссертации. Диссертация включает: введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 179 страницах, документирована таблицами (25) и иллюстрирована рисунками (37). Список литературы включает 114 отечественных и 84 зарубежные работы.

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом настоящего исследования послужила измерительная система, состоящая из закрытого амперометрического кислородного датчика, открытой измерительной ячейки и вспомогательного оборудования, при помощи которой регистрировалось потребление кислорода моделью, имитирующей аэробный биологический объект. Выбор определялся широким распространением подобного рода измерительных систем в биохимических исследованиях и очевидным наличием у нее полного комплекса факторов, искажающих результаты измерения потребления кислорода.

Измерения проводились с использованием двух близких по параметрам кислородных датчиков: N5972 (промышленного изготовления; пр-во ПНР) и разработанного автором кислородного датчика с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ). Все замеры производились в десятикратной повторности (n=10) за исключением специально оговоренных случаев.

В качестве модели аэробного биологического объекта использовался ~0,01М свежеприготовленный раствор Na2SO3, концентрация которого перед каждым замером уточнялась титриметрически. Моделью среды инкубации служил водный раствор KCl (60 г/л), практически изотонический по отношению к электролиту датчика, что исключало искажение показаний, связанное с осмотическими явлениями на мембране.

Всего в ходе работы было записано и расшифровано 130 регистрационных кривых поглощения кислорода моделью аэробного биологического объекта, пассивного насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом и обмена кислородом между инкубационной средой и собственной кислородной емкостью измерительной системы. Проведено 240 контрольных титриметрических определений действительного количества поглощенного кислорода и 60 определений изменения концентрации раствора Na2SO3 под воздействием атмосферного кислорода.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый этап работы, изложенный в главе 3, был посвящен выявлению факторов, оказывающих наибольшее искажающее воздействие на результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами, а также разработке оборудования и модельных систем, позволяющих определить количественный вклад данных факторов в величину погрешности измерения.

На основании результатов измерения потребления кислорода модельным поглотителем в насыщенной атмосферным кислородом инкубационной среде, полученных при использовании измерительной системы на базе кислородного датчика N5972, было показано следующее.

1. Результаты измерений в исходно бескислородной системе (обработка измерительной ячейки раствором Na2SO3 и длительная продувка азотом), оказались воспроизводимо завышены на 18% по сравнению с действительными значениями (СV=8%), а в системе, насыщенной атмосферным кислородом - воспроизводимо занижены на 39% (СV=7%). Таким образом было показано, что в первом случае в системе присутствует неучтенный потребитель, а во втором - источник кислорода.

2. Результаты, полученные в бескислородной системе, как показано выше, в меньшей степени отличались от действительного значения, чем полученные в системе насыщенной кислородом. Таким образом, в обоих случаях измерение происходило на фоне притока кислорода извне.

3. При использовании воды в качестве среды инкубации чувствительность датчика в серии последовательных замеров прогрессивно снижалась: кривые становились более пологими, значение минимума повышалось, но после выдерживания датчика в течение нескольких часов в 5% растворе Na2SO3 его работоспособность полностью восстанавливалась.

4. При использовании в качестве среды инкубации изотонического по отношении к электролиту датчика раствора KCl, эффект «растягивания» кривых поглощения полностью устранялся, что сопровождалось снижением относительной погрешности измерения от -20,2 до -10% с одновременным возрастанием CV от 5 до 9%.

Таким образом, в результате предварительных экспериментов было установлено следующее:

- рассматриваемая измерительная система обладает собственной кислородной емкостью;

- атмосферный кислород во время регистрации потребления кислорода объектом диффундирует в инкубационную среду, что способствует занижению результата измерения;

- использование инкубационных сред, гипотонических по отношению к электролиту закрытого кислородного датчика, ведет к искажению характера кривых потребления и росту погрешности измерения.

На основании выявленных особенностей измерительной системы было предложено:

- в качестве исходного для проведения измерений использовать кислородный режим «100» (измерительная система предварительно насыщена кислородом путем длительной продувки атмосферным воздухом), как более стабильный и не требующий усилий для своего поддержания;

- в качестве модели инкубационной среды использовать водный раствор KCl (60 г/л), как не вызывающий искажения регистрационных кривых за счет осмотических эффектов на мембране кислородного датчика;

- отказаться от использования кислородного датчика N5972, как обладающего избыточно высокой собственной кислородной емкостью, величина которой существенно варьирует от замера к замеру, и разработать конструкцию амперометрического кислородного датчика, обладающего низкой и стабильной кислородной емкостью.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.