WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Структура липополисахаридов и избирательная вирулентность возбудителей фоторабдоза

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи







киршева надежда алексеевна




СТРУКТУРА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

И ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ВИРУЛЕНТНОСТЬ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФОТОРАБДОЗА


03.02.03 – микробиология

03.01.04 – биохимия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук






Оболенск – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:
Дентовская Светлана Владимировна – доктор медицинских наук
Книрель Юрий Александрович – доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Коломбет Любовь Васильевна – доктор биологических наук, заведующий научной частью ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Шепеляковская Анна Олеговна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «25» октября 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «24» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Род Photorhabdus семейства Enterobacteriaceae включает три вида подвижных биолюминесцентных почвенных грамотрицательных бактерий: Photorhabdus temperata, Photorhabdus luminescens и Photorhabdus asymbiotica. Бактерии всех трех видов – симбионты энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae, вместе с которыми вызывают гибель личинок широкого круга насекомых, что способствовало использованию P. luminescens в качестве биоинсектицида (Forst S. et al., 1997). Бактерии P. asymbiotica, в отличие от P. temperata и P. luminescens, патогенны для людей. К настоящему времени в клинической практике зафиксировано 18 случаев инфицирования людей (шесть в США и 12 в Австралии) бактериями P. asymbiotica (Gerrard J.G. et al., 2011). Не исключено, что благодаря трудностям при идентификации патогена число заболевших людей значительно выше, чем это отражено в научных публикациях (Gerrard J. et al., 2004). В ряде случаев бактерии P. asymbiotica, выделенные из клинических образцов, расценивали как вторичную микрофлору раневых поверхностей, но не этиологический агент заболевания. Изучение патогенности Photorhabdus spp. до настоящего времени фокусировалось на использовании в качестве экспериментальной модели насекомых (Hallem E.A. et al., 2007; Khush R.S., Lemaitre B., 2000; Tzou P. et al., 2002; Vodovar N. et al., 2004), поэтому для изучения фоторабдоза человека необходим подбор адекватных теплокровных модельных лабораторных животных.

Известно, что одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), а его структура определяет исход взаимодействия патогена с факторами врожденного иммунитета хозяина (Morrison D.C., Ryan J.L., 1987; Raetz C.R., Whitfield C., 2002; Montminy S.W., et al. 2006). Способность представителей рода Photorhabdus эффективно преодолевать врожденный иммунитет у насекомых, а в случае P. asymbiotica – и у людей, напоминает таковую у бактерий рода Yersinia – Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica – также патогенных и для насекомых, и для млекопитающих (Heermann R., Fuchs T.M., 2008). В то же время установлено, что образование наиболее вирулентного вида рода Yersinia – Y. pestis – сопровождалось существенным изменением структуры ЛПС, в том числе утратой способности синтезировать ЛПС с О–полисахаридной цепью (Skurnik M. et al., 2000). P. Wilkinson et al. (2009) высказали предположение о том, что в ходе инфекции у людей может модифицироваться структура ЛПС P. asymbiotica, как это происходит у других грамотрицательных патогенов, способных уклоняться от распознавания иммунной системой млекопитающего. Показано, что представители рода Photorhabdus синтезируют ЛПС в S–форме (Bennett H.P.J., Clarke D.J., 2005), включающий О–полисахарид (О–антиген), олигосахаридную часть (кор) и липид А, однако его структура до настоящей работы не была определена ни у одного из видов, входящих в этот род.



Систематическое структурное исследование ЛПС и изучение биологических свойств бактерий рода Photorhabdus, отличающихся по патогенности для человека, необходимы для выяснения механизмов избирательной вирулентности представителей различных видов Photorhabdus для теплокровного хозяина.

Цель исследования – получение новых сведений о структурной организации липополисахаридов и биологических свойствах бактерий рода Photorhabdus, связанных с патогенностью для человека.

Задачи исследования

1. Создать и охарактеризовать представительную коллекцию штаммов Photorhabdus spp.

2. Определить структуру ЛПС представителей различных видов и подвидов рода Photorhabdus и оценить характер влияния температуры выращивания штаммов Photorhabdus spp. на структуру ЛПС.

3. Сравнить биологические свойства штаммов Photorhabdus spp., отличающихся по патогенности для человека (вирулентность для мышей, устойчивость к катионным антимикробным пептидам и комплементу сыворотки крови, эндотоксическую активность ЛПС).

Научная новизна

Впервые установлены структуры О–полисахаридов рода Photorhabdus. В их составе обнаружены редко встречающиеся компоненты: D–глицеро–D–манно–гептоза и 3,6–дидезокси–3–формамидо–D–глюкоза в P. luminescens, 2–ацетамидо–4–амино–2,4,6–тридезокси–D–галактоза и 2аминоэтилфосфатное производное N–ацетил–D–галактозамина в P. temperata. Особенностью О–полисахаридов P. asymbiotica является присутствие необычного N–ацильного заместителя 2,4–диамино–2,4,6–тридезоксиглюкозы (Qui4N) – N–формилглицила, который ранее не был обнаружен в бактериальных полисахаридах.

Впервые определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС представителей трех видов рода Photorhabdus и обнаружено влияние температуры культивирования бактерий на содержание D–глицеро–D–манно–гептозы и степень фосфорилирования кора. Получены первые данные о степени ацилирования липида А Photorhabdus spp., позволившие обосновать одинаковую эндотоксическую активность in vivo препаратов ЛПС P. asymbiotica и P. luminescens с одной стороны и Y. pestis с другой стороны.

Впервые показано, что штаммы P. asymbiotica и P. luminescens, в отличие от штаммов P. temperata, патогенны для лабораторных мышей, и определены величины LD50 для мышей BALB/c представителей двух подвидов P. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis. Выявлена гетерогенность представителей трех видов Photorhabdus spp. по устойчивости к антимикробным катионным пептидам и комплементу нормальной человеческой сыворотки.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные фундаментальные сведения о тонком строении ЛПС Photorhabdus spp. открывают путь для функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов их биосинтеза. Обнаруженное структурное разнообразие О–полисахаридов Photorhabdus spp. при низком разнообразии структур P. asymbiotica на уровне подвидов имеют значение для уточнения таксономического положения изученных бактерий. Выявленное сходство О–полисахаридов P. asymbiotica и таксономически отдаленных микроорганизмов, включая Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio anguillarum, Francisella tularensis и Francisella novicida, проливает свет на эволюционную историю О–антигенов грамотрицательных бактерий. Продемонстрированное на мышиной модели соответствие P. asymbiotica третьему и четвертому постулатам ГенлеКоха (Koch R., 1882) окончательно доказывает этиологическую роль этих бактерий в развитии фоторабдоза теплокровных животных.

Создана и охарактеризована коллекция из 23 штаммов Photorhabdus spp., включающая штаммы, относящиеся к различным внутривидовым группам P. asymbiotica возбудителя нового инфекционного заболевания человека фоторабдоза. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ–Оболенск» (п. Оболенск, Московская обл.) депонировано 23 штамма Photorhabdus spp.

Выделенные из штаммов Photorhabdus spp. препараты ЛПС в настоящее время применяются в иммунологических исследованиях в отделе иммунобиохимии патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ (п. Оболенск, Московская обл.). Выявленные структурные особенности O–полисахаридных цепей ЛПС бактерий Photorhabdus spp. могут послужить основой для серологического типирования этих бактерий.

Разработанная мышиная модель фоторабдоза может быть использована для изучения формирования и течения экспериментальной фоторабдозной инфекции, а также создания эффективных схем антимикробной терапии заболевания.





Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного естественно–научного института и аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ.

Методология и методы исследования

В исследовании использовались экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, методы аналитической химии углеводов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установленные структуры О–полисахаридов (O–антигенов) энтеробактерий рода Photorhabdus и идентифицированные в их составе компоненты, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, являются потенциальной основой для разработки схемы серотипирования бактерий этого рода.

2. P. asymbiotica соответствует всем четырем постулатам Генле–Коха и является этиологической причиной развития фоторабдоза теплокровных животных, а мыши линии BALB/c – адекватная модель для воспроизведения фоторабдоза человека.

3. Бактерии P. luminescens subsp. laumondii при подкожном введении в высокой дозе способны воспроизводить клиническую картину фоторабдоза, не вызывая гибели мышей линии BALB/c.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Основные положения диссертационной работы представлены на II Научно–практической школе–конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (25–27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.); 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (19–22 сентября 2010 г., Финляндия); III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (28–30 марта 2011 г., Москва); III Научно–практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (31 мая–2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.); 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2–6 сентября 2012 г., Суздаль).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 28 января 2010 г. (протокол № 1, приказ № 14 от 04 февраля 2010 г.) с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 15 марта 2013 г. (протокол № 3). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 29 от 29 апреля 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе, три статьи в рецензируемых изданиях (из них одна – в отечественном, две – в международном) и пять работ – в материалах конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и список использованных источников, включающий 11 работ отечественных и 219 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Приложения состоят из двух статей, опубликованных по теме диссертации.

Основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

Объектами исследования служили 23 штамма Photorhabdus spp. (пять штаммов P. temperata, шесть – P. luminescens и 12 – P. asymbiotica), один штамм Y. pseudotuberculosis и один штамм E. coli, полученные из коллекций Университета Монпелье (Франция), Ирландского национального университета (Корк, Ирландия) и «ГКПМ–Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ, а также мыши нелинейные породы Swiss Webster, линейные: BALB/c, C57BL/6, CBA и С3Н/НеN (19 ± 2) г.

Микробиологические методы

Бактерии выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria–Bertani (LB) и Хоттингера. Для выделения ЛПС штаммы выращивали с аэрацией при температурах 28 °C или 37 °C в ферментере New Brunswick Scientific с рабочим объемом 5 л в жидкой среде LB при pH 7,1. Основные морфологические, культуральные и биохимические свойства полученных штаммов Photorhabdus spp. оценивали, как описано ранее (Givaudan A. et al., 1995; Farmer J.J. et al., 1989). Чувствительность штаммов Photorhabdus spp. к антибиотикам определяли методом дисков (Руководство по профилактике чумы, 1972). Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) полимиксина B (PMB) (AppliChem GmbH, Germany) проводили, как описано ранее (Hitchen P.G. et al., 2002). Бактерицидные свойства сывороток изучали по опубликованному протоколу (Barnes M.G. et al,. 2001).

Биохимические и аналитические методы

Препараты ЛПС из сухой бактериальной массы штаммов Photorhabdus spp. выделяли методом экстракции горячим водным фенолом (Westphal O., Jann K., 1965) и очищали последовательным ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот и белков с повторным ультрацентрифугированием (105000  g, 4 ч). Очищенные препараты ЛПС лиофилизировали. Содержание белка в препаратах ЛПС оценивали методом гель–электрофореза, а присутствие нуклеиновых кислот определяли, как описано ранее (Knirel Y.A. et al., 2005).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.