WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов enterobacteriaceae

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ПРЯМЧУК

СЕРГЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

идЕНТиФИкациЯ СПЕЦИФИЧНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МНОЖЕСТВЕННО-устойчивЫХ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ENTEROBACTERIACEAE

03.02.03 микробиология

03.02.07 генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск 2011

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Михайлова Наталья Александровна

доктор биологических наук Игнатов Сергей Георгиевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «26» декабря 2011 года в 13 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан «_25_» _ноября_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами (Livermore, 2009). Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальбным препаратам и способы распространения генов МЛУ (Wright, 2010). Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер (Warren et al, 2008; Козлов, 2000).

Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков (Hawkey&Jones, 2009). Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно (Nikaido, 2009).

Быстрое определение видовой принадлежности возбудителей инфекций и их чувствительности к антибактериальным препаратам зачастую является вопросом жизни и смерти пациентов. Методы, используемые для этого в рутинной практике, варьируют в зависимости от оснащенности клинических лабораторий и подготовленности персонала - от микробиологических, в разной степени автоматизированных, до молекулярно-биологических. Наиболее перспективными с точки зрения быстроты и точности получаемого ответа являются разные варианты скрининга, основанного на амплификации ДНК с помощью специфичных праймеров, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), в стандартном режиме и в режиме реального времени (Fluit et al, 2001). Преимуществами данного метода являются быстрота, надежность и специфичность; недостатком – то, что выявлению подлежат только уже описанные ранее последовательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазмиды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний (Aminov, 2010).



Цель исследования - выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003-2007 гг.

Задачи исследования:

  1. Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (нозокомиальных) штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003-2007 гг.
  2. ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.
  3. Разработка алгоритма идентификации генов blaCTX-M, детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).
  4. Изучение генетического окружения генов blaCTX-M и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.
  5. Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.
  6. Создание перечня генетических маркеров антибиотикорезистентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.

Научная новизна. Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae - возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003-2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев (75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов blaCTX-M, позволяющий определить 49 генов из 96, а остальные 47 - в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов blaCTX-M подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последовательностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген blaCTXM116 и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены blaCTXM локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены blaCTXM, внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых – 3.


Практическая значимость. Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерий – возбудителей нозокомиальных инфекций (n=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (n=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотикоустойчивости (n=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003-2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов blaCTX-M, детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 – «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Госпитальные штаммы энтеробактерий, выделенные в различных регионах РФ в 2003-2007 гг., в большом проценте случаев являются носителями генов резистентности к антимикробным препаратам различных функциональных групп одновременно, что определяет их множественную устойчивость.
  2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз TEM, SHV, OXA, AmpC и CTX-M типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.
  3. Гены blaCTX-M – превалирующие детерминанты устойчивости к бета-лактамам (77 % штаммов) - локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcp1, IS26, IS903, orf513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.
  4. Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены blaCTXM до индивидуального гена (51 %) или в составе небольших подгрупп (49 %).
  5. В геноме нозокомиального штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген blaCTXM116 (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749; учетный номер в специализированной базе данных Lahey – «CTX-M-116»), кодирующий ранее не описанный фермент CTX-M-типа, имеющий гибридную природу.
  6. Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование антибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38 %) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003-2007 гг.
  7. Устойчивости к хинолонам у 23 % штаммов Enterobacter spp. определяется наличием плазмидных генов qnr, сравнительно новым молекулярным механизмом устойчивости к данному классу препаратов.
  8. Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в клиниках РФ.

Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутрибольничных и пищевых инфекций» (2006-2010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61





«Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005-2007).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н.К., к.м.н. Абаевым И.В., к.б.н. Кругловым А.Н., н.с. Печерских Э.И., к.б.н. Коробовой О.В., к.б.н. Шишковой Н.А., к.м.н. Анисимовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю.Н., к.м.н. Асташкиным Е.И., к.б.н. Пачкуновым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э.А., д.м.н., проф. Сидоренко С.В. и д.м.н., проф. Дятловым И.А.

Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4, 2006; VII Международный Конгресс МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии. 30 мая – 1 июня 2006 г., Москва; The 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30, 2006; The 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., Россия; The 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс МАКМАХ/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая – 1 июня 2007 г.; The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г.; Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18–19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.; X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009; The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.; Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г.; XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 22 публикациях, в том числе в трех научных работах, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, выводы и указатель литературы, включающий 145 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 46 рисунками и 20 таблицами.

Содержание работы


Материалы и методы исследования



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.