WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации reca и recd

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи


Лапин

Александр Александрович

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВАРИАНТОВ ВАКЦИННОГО ШТАММА FRANCISELLA TULARENSIS

С ДЕЛЕТИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ СИСТЕМЫ

РЕКОМБИНАЦИИ RECA И RECD


03.02.03 – микробиология

03.01.03 – молекулярная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук




Оболенск – 2011

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат физико-математических наук Павлов Виталий Михайлович

Кандидат медицинских наук Мокриевич Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Гремякова Татьяна Андреевна

Кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «____»___________ 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «____»___________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туляремия – зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. На территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (по данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, в 2010 г. зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 г. – 57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.

Возбудителем туляремии является микроорганизм Francisella tularensis. В современной классификации выделяют четыре подвида F. tularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica, subsp. mediaasiatica и subsp. novicida. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает F. tularensis subsp. tularensis, циркулирующий на территории Северной Америки (Ellis et al., 2002).

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, которая формирует длительный напряженный иммунитет. Основным недостатком данной вакцины является ее некоторая реактогенность и нестабильность (Олсуфьев с соавт., 1960). Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из способов стабилизации генома вакцинного туляремийного штамма представляется инактивирование элементов системы гомологичной рекомбинации.

Известно, что инактивирование гена recA у вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG приводило к стабилизации генома данного микроорганизма и не влияло на его протективные свойства (Keller et al., 2008). Инактивация генов recA и recBC в клетках Salmonella приводила к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае recA мутантов) (Buchmeier et al., 1993). Наличие дефекта в гене recD у Salmonella, продуктом которого является белок RecD, обладающий АТФ-азной (Chen et al., 1997) и хеликазной (Taylor et al., 2003) активностями, также приводило к аттенуации бактерий Salmonella для мышей и снижению их пролиферации в макрофагах (Cano et al., 2002).

Ранее было показано наличие функционально-активного recA-подобного гена в геноме вакцинного штамма F. tularensis (Павлов с соавт., 1991) и в геноме F. tularensis subsp. novicida (Berg et al., 1992). При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности геномов видов Francisella были обнаружены также recD-подобные гены (Larsson et al., 2005).

Учитывая вышеизложенные факты, изучение влияния recA- и recD-подобных генов F. tularensis на генетические и биологические свойства вакцинного штамма туляремийного микроба является на настоящий момент актуальной задачей, решение которой необходимо для создания нового поколения вакцинного штамма, а также для изучения эволюции туляремийного микроба.

Цель исследования: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма F. tularensis.



задачи исследования

  1. Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD у F. tularensis.
  2. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recA.
  3. Получение продуцента E. coli Bl21(DE3), экспрессирующего рекомбинантный белок RecA F. tularensis, выделение и очистка белка RecA.
  4. Получение антител к рекомбинантному белку RecA F. tularensis и анализ экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба.
  5. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recD.
  6. Изучение влияния генов recA и recD на свойства вакцинного штамма F. tularensis 15/10.
  7. Выбор последовательностей нуклеотидов в гене recD для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов F. tularensis; конструирование праймера, содержащего Chi-сайт E. coli, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.

Научная новизна

Впервые получены варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с инактивированными генами системы гомологичной рекомбинации recA и recD. Показано, что при инактивации гена recA в геноме штамма F. tularensis 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к аттенуированию штамма, при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

Практическая ценность работы

Созданы плазмиды pPVrecA, pPVrecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации recA и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (ГКПМКК-Оболенск) депонированы авторские штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15/10recA (рег. номер 6622.) с делецией гена recA, и F. tularensis subsp. holarctica 15/10 recD (рег. номер В-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» № 2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).

положения, выносимые на защиту

1. Делеция гена recA в геноме вакцинного штамма F. tularensis 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена recA сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм F. tularensis 15/10recA сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лиофильно высушенной культуры F. tularensis 15/10recA не меняется в процессе ее хранения.

2. Антитела к рекомбинантному белку RecA распознают нативный белок RecA штамма F. tularensis 15/10. Количество белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.

3. Делеция гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к подавлению гомологичной рекомбинации. Штамм F. tularensis 15/10recD не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными ростовыми свойствами и замедленной способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.

4. У штамма F. tularensis 15/10 с инактивированным геном recA на порядок снижена вирулентность для мышей, при сохранении его протективных свойств. Делеция гена recD у вакцинного туляремийного штамма приводит к его аттенуированию и сохранению протективных свойств.

5. Созданная система праймеров и зондов на основе вариабельной последовательности гена recD позволяет проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий Chi-последовательность E.coli, позволяет различать подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии (ЛМТ) ФБУН ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 11.06.2009 г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 гг.)».



Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.





Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях журнала из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в двух принятых к рассмотрению заявках на патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 20 работ отечественных и 151 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В первых главах приведены данные о возбудителе туляремии и лабораторной диагностики данной инфекции. Изложена история получения и использования туляремийного вакцинного штамма. Проанализированы литературные данные, касающиеся функционирования системы гомологичной рекомбинации у микроорганизмов. Приведена история исследования модели гомологичной рекомбинации. Основная часть обзора посвящена работам по исследованию функционирования основных ферментов системы гомологичной рекомбинации - белкам RecA и RecBCD. Приведены данные об организации генома F. tularensis. Рассмотрены подходы генетического изучения туляремийного микроба. Заключительная часть литературного обзора посвящена вопросу применения генетической модификации системы рекомбинации у вакцинных штаммов в том числе и F. tularensis, для стабилизации и аттенуации вакцинных штаммов.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали полученные из коллекции ГКПМКК-Оболенск бактериальные штаммы: - F. tularensis subsp. tularensis - 3 штамма, F. tularensis subsp. mediasiatica - 2 штамма, F. tularensis subsp. Novicida - 1 штамм, F. tularensis subsp. holarctica - 6 штаммов, из которых F. tularensis subsp. holarctica biovar japonica - 3 штамма и вакцинный штамм F. tularensis, subsp. holarctica 15/10, а также гетерологичные штаммы Y. pestis EV76, Y. pseudotuberculosis 1779, B. anthracis СТИ-1 и E. coli JM 83, E. coli DH5, E. coli S17-1 и E. coli Bl21(DE3).

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J744.A1 были получены из Российской Коллекции клеточных культур, г. Санкт-Петербург, Россия.

В работе были использованы мыши линии BALBc (возраст 6-8 нед.) и беспородные белые мыши массой 18-20 г, полученные из вивария ФБУН ГНЦ ПМБ, соответствующие требованиям к качеству лабораторных грызунов (Лившиц, 1978).

Культивирование штаммов E. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °С (Miller, 1972) с добавлением при необходимости антибиотиков: хлорамфеникола (Cm) 10 мг/л, ампициллина (Ap) 100 мг/л, канамицина (Km) 40 мг/л и 5% сахарозы (Suc). Культивирование штаммов F. tularensis проводили при температуре 37 С на среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде (Лапин с соавт., 2009), при необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: полимиксин (Pm) 100 мг/л, Km 10 мг/л, Cm 3 мг/л, стрептомицин (Str) 100 мг/л и 5% Suc.

Лиофильное высушивание подготовленных суспензий объемом 2 мл проводили с использованием сушилки Bench Top SLC "Virtis" 4 k (США) при автоматическом режиме подвода тепла (2030 0С) в течение 24 ч (глубина вакуума - 200 мТорр).

Молекулярно-биологические работы выполняли в соответствии с руководством Маниатиса с соавт. (1984). Перенос рекомбинантных плазмид в клетки штаммов E. coli осуществляли “кальциевым” методом трансформации, а в клетки F. tularensis15/10 - методом конъюгации (Golovliov et al., 2003).

Олигонуклеотиды синтезировали в компании ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc, США) c оптическим ПЦР-модулем.

Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США) в компании «Синтол» (Москва, Россия).

Конструирование штаммов с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD на основе штамма F. tularensis subsp. holarctica 15/10 проводили с помощью аллельного обмена по методике Golovliov et al (2003). Для синтеза модифицированных фрагментов генов recA и recD использовали ампликоны, полученные с помощью праймеров FSA, RBA, FBA, RSA и FSD, RBD, FBD, RSD, соответственно. Дефектные аллели генов recA и recD встраивали в SalI сайт суицидного вектора pPV. Для комплементации мутаций в генах recA и recD, фрагменты хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с функционально активным геном recA встраивали в SalI сайт вектора pHV33mob, а фрагмент ДНК с геном recD - в SalI сайт векторов pHV33-mob и pUC19/pK194. Для получения плазмиды pET23(b+)/RecA-(His)6, экспрессирующей белок RecA F. tularensis в клетках E. coli, ген recA F. tularensis 15/10 встраивали между сайтами NdeI и XhoI в векторе pET23(b+).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.