WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Низова Анастасия Валерьевна

Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй

линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных

с хроническим течением туберкулеза

03.00.07 – Микробиология

03.00.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

кандидат биологических наук Степаншина Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович

доктор медицинских наук, Денисов Александр Александрович

Ведущая организация – Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита состоится «18» декабря 2009 г. в 12 00 часов на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии.

Автореферат разослан «12» ноября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туберкулез остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети населения планеты [Bloom B.R., 2002, Никитин А.В., 2006]. Ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. В Российской Федерации показатель заболеваемости населения туберкулезом составляет около 86 случаев на 100 000 населения [Вартанян Ф.Е. и др., 2007; Цыбикова Э.Б. и др., 2007]. Примерно третья часть от общего числа больных являются бактериовыделителями, т.е. существует огромный резервуар распространителей инфекции [Дмитриев В.А., 2008].

Одной из причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу является увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к специфическим химиопрепаратам. Особую тревогу вызывает рост числа штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. одновременно устойчивых к наиболее активным противотуберкулезным препаратам – изониазиду и рифампицину). Туберкулезный процесс, вызванный микобактериями, устойчивыми к данным препаратам, трудно поддается лечению и приводит к развитию хронических форм заболевания [Хоменко А.Г. и др., 1996].

Повсеместное распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза требует пересмотра стандартных схем противотуберкулезной терапии. Для лечения больных туберкулезом наряду с препаратами первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид), все чаще применяют новые режимы химиотерапии с использованием препаратов второй линии (протионамид, канамицин, амикацин, капреомицин, циклосерин, рифабутин, ПАСК, офлоксацин). Для достижения эффективных результатов лечения необходимо знание спектра и уровня лекарственной устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к этим препаратам.

При оценке лекарственной устойчивости микобактерий учитывают критические концентрации противотуберкулезных препаратов. Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же лекарственного препарата может быть различна. Значения критических концентраций существенно отличаются и при использовании разных методов определения лекарственной устойчивости [Kim S.J., 2005]. В России для тестирования устойчивости микобактерий к химиопрепаратам традиционно используют метод абсолютных концентраций и плотную яичную питательную среду Левенштейна-Йенсена. В настоящее время используемые в данном методе критические концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии определены, тогда как критические концентрации лекарственных препаратов второй линии для M. tuberculosis носят лишь рекомендательный характер и требуют дополнительных исследований с использованием современных клинических штаммов [Приказ № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., 2003 г.].

Известно, что при неадекватной химиотерапии в очаге поражения у больного туберкулезом создаются условия для селекции лекарственно-устойчивых микобактерий, что в значительной степени снижает эффективность лечения, увеличивает его стоимость, повышает риск смертельного исхода заболевания. Помимо этого, пациенты, страдающие лекарственно-устойчивым туберкулезом, являются потенциально опасными для окружающих. Поэтому определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет большое значение для оптимизации тактики химиотерапии больных туберкулезом, контроля эффективности лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий.



Цель работы

Анализ устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением заболевания, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации.

Задачи исследования

  1. Создать панель современных клинических штаммов M. tuberculosis, “предположительно” чувствительных и “предположительно” устойчивых к противотуберкулезным препаратам второй линии: канамицину, капреомицину и офлоксацину.
  2. Определить критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемые для оценки лекарственной устойчивости M. tuberculosis методами абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и пропорций на среде Middlebrook 7Н10.
  3. Провести мониторинг штаммов M. tuberculosis, полученных от больных с хронической формой туберкулёза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации, обратившихся за медицинской помощью в течение 2003-2005 гг., для определения устойчивости их к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.

Научная новизна работы

  1. Впервые определены критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций с использованием охарактеризованной микробиологическими и молекулярно-биологическими методами панели современных клинических штаммов M. tuberculosis.
  2. Проведен мониторинг устойчивости штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных хронической формой туберкулеза (Центральный и Приволжский регионы, 2003-2005 гг.), к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.
  3. Методом ПЦР-секвенирования в гене pncA выявлены ранее не описанные мутации, детерминирующие устойчивость M. tuberculosis к пиразинамиду.

Практическое значение работы

Разработаны методические рекомендации "Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левенштейна-Йенсена". Данные рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательских институтах, проводящих работы по определению лекарственной устойчивости микроорганизмов и разрабатывающих новые методы ее тестирования; в бактериологических лабораториях фармацевтических производственных учреждений, выполняющих работы по определению противотуберкулезной активности лекарственных препаратов.

Разработан универсальный алгоритм, который может быть использован при определении критических концентраций других противотуберкулезных химиопрепаратов. Это особенно важно, так как существуют резервные препараты и ряд препаратов второй линии, для которых показатели критических концентраций остаются пока неизвестными, что ограничивает возможность их использования в клинической практике.

Проведена оценка вклада отдельных мутаций в формировании устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Полученные данные имеют существенное значение при разработке молекулярно-биологических диагностических систем. Информация о впервые выявленных мутациях в гене pncA внесена в базу данных генетических последовательностей (GenBank).

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов

M. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.

  1. Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов M. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций – 2 мкг/мл.
  2. Выявлено 15 новых мутаций в гене pncA детерминирующих устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31ACC, 49CAC, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-A-9, Ins 64-A-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.
  3. Среди штаммов M. tuberculosis, выделенных из мокроты больных с хронической формой туберкулеза легких (n=325), проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации в течение 2003-2005 гг., 62,5% штаммов устойчивы к изониазиду, 54,2% – к рифампицину, 61,8% – к стрептомицину, 37,2% – к этамбутолу, 30,5% – к пиразинамиду, 32,3% – к канамицину, 24,0% – к капреомицину и 7,7% – к офлоксацину.
  4. Установлено, что устойчивость штаммов M. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев – в гене rpoB, к стрептомицину в 52,7% случаев – в гене 16SrRNA и в 22,4% – в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев – в гене embB, к пиразинамиду в 100% случаев – в гене pncA, к канамицину в 87,6% случаев – в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев – в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев – в гене gyrA.

Апробация работы Результаты работы доложены на: 36-й Международной конференции "Здоровье легких" Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Париж, 2005), II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" (Москва, 2007), Проблемном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии "Патогенез и контроль распространения лекарственно-устойчивых организмов" (Бангкок, 2008), 5-м конгрессе Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Дубровник, 2009).





Публикации По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 100 работ отечественных и 119 работ зарубежных авторов. Работа содержит 14 рисунков и 15 таблиц.

Собственные исследования

Материалы и методы

В работе использованы штаммы M. tuberculosis, выделенные из мокроты больных хроническим туберкулезом легких. Штаммы получены из противотуберкулезных диспансеров городов Москва, Тула, Серпухов, Иваново и Нижний Новгород. Лабораторный референс-штамм M. tuberculosis H37Rv поступил из ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Референс-штамм M. bovis BCG получен из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Принадлежность бактериальных культур к виду M. tuberculosis подтверждена культуральными и биохимическими методами согласно приказу № 109 от 21 марта 2003 г. ''О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации''. При идентификации микобактерий учитывали скорость роста, пигментацию и морфологию колоний, а так же способность к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 500-1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез М., 2001]. Ниациновый тест проводили согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Бараускене. Активность и термостабильность каталазы определяли по методике Kent P. T. et al., 1985. Для определения устойчивости микобактерий к пиразинамиду использовали тест на наличие пиразинамидазной активности. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Приказ №558 ''Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе'' М., 1978]. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам тестировали методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и методом пропорций на среде Middlebrook 7Н10 [Приказ МЗ РФ № 109 М., 2003]. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) канамицина, капреомицина и офлоксацина определяли методом серийных разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7H10. Критические концентрации противотуберкулезных препаратов второй линии были установлены в результате анализа МПК препаратов, обработанных с помощью графических ресурсов программы Microsoft Office Excel 2003.

Для RFLP-IS6110-типирования M. tuberculosis использовали методику Van Embden J.D.A. et al., 1995. Компьютерный анализ полученных данных проводили методом UPGMA с помощью пакета программ GelCompar II (version 2.5, для Windows 98, Бельгия). Штаммы сполиготипировали по классической методике Kamerbeek J. et al., 1997.

Метод гибридизации на нуклеотидных биочипах использовали для выявления мутаций в гене rpoB, детерминирующих устойчивость микобактерий к рифампицину. ПЦР-секвенирование генов katG, rpoB, rpsL, 16SrRNA, embB, pncA, tlyA, gyrA и gyrB, обуславливающих устойчивость штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, определяли при помощи автоматического секвенатора MegaBase 750. При поиске гомологии нуклеотидных последовательностей использовали программу Vector NTI ("InforMax", США).

Результаты исследования и их обсуждение

Создание панели клинических штаммов M. tuberculosis

Была сформирована стандартная панель современных клинических штаммов M. tuberculosis, включающая 24 "предположительно" чувствительных штаммов и 70 "предположительно" устойчивых к изучаемым лекарственным препаратам штаммов. "Предположительно" чувствительные культуры были выделены из мокроты больных, не принимавших изучаемый препарат, и не имеющих мутации в целевых генах M. tuberculosis. "Предположительно" устойчивые культуры выделены из мокроты больных, принимавших изучаемый препарат, и имеющих мутации в целевых генах M. tuberculosis.

Для исключения возможного изогенного происхождения клинические штаммы M. tuberculosis были тестированы методом сполиготипирования. Полученные данные представлены в виде восьмеричного кода и схематических профилей гибридизации в Табл 1.

Таблица 1

Сполиготипы клинических штаммов M. tuberculosis

Сполигограмма

( – наличие сигнала, – отсутствие сигнала при гибридизации)

Сполигопаттерн

(восьмеричный код)

Сполиго-

семейство

Количество

штаммов

000000000003771

Beijing

34



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.