WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Конструирование аттенуированных штаммов yersinia  pestis с пониженной реактогенностью

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АГЕЕВ

Сергей Андреевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS

С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ

03.02.03– микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск – 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна

Доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Жемчугов Владислав Евгеньевич

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится «20» октября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФГУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «20» сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы:

За двести лет своего существования вакцинология достигла поразительных успехов - возбудитель оспы сохранился только в коллекциях двух лабораторий, заболеваемость целым рядом инфекций (полиомиелит, дифтерия и др.) удалось снизить до такой степени, что можно также надеяться на их полное искоренение, а сотни опаснейших болезней взяты здравоохранением под контроль благодаря классическим вакцинам, полученным методами инактивации и аттенуации. Способы получения вакцин с тех пор значительно изменились. Сегодня развитие методов молекулярной биологии, генной медицины, органической химии и иммунологии позволяют выделять очищенные нативные и получать синтетические антигены, направленно конструировать продуценты рекомбинантных протективных антигенов с заданными свойствами на основе технологичных штаммов бактерий или высших растений ("съедобные вакцины") и прецизионно аттенуированные мутанты и живые векторы на основе бактерий и вирусов, экспрессирующих протективные антигены in situ; использовать ДНК, РНК и полисахариды для индукции запрограммированного релевантного иммунного ответа [Медуницын Н.В. 1997; Levine, Sztein, 2004; Stanley, Plotkin, 2005].

Основные требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам, включают: безупречный уровень безопасности для всех слоев населения, в том числе лиц с измененной иммунной реактивностью (младенцы, беременные, пожилые, лица с нарушениями иммунного статуса); создание напряженного и долгосрочного уровня защиты, развивающегося не позднее чем через 2-3 недели после однократного введения вакцинного препарата; безинъекционный способ введения в организм (через рот, нос, слизистые); возможность комбинирования с другими вакцинами; устойчивость к внешним воздействиям и отсутствие специальных требований для хранения; и, наконец, экономичность и простоту изготовления [Levine, Sztein, 2004]. Однако до сих пор не существует “идеальной вакцины”, полностью соответствующей всем перечисленным требованиям. Большинство вакцинных препаратов обладает лишь частью из этих характеристик, и каждый из них имеет свои недостатки и ограничения.

В последние годы наибольшее внимание в разработке препаратов для вакцинопрофилактики чумы уделяется созданию субъединичных вакцин, содержащих лишь протективные антигены и неспособных вызывать инфекционный процесс даже у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако и они не являются идеальными, т.к. слабо индуцируют клеточное звено иммунитета и не могут предохранять от гибели после заражения штаммами, полностью утратившими способность к продукции антигена, используемого для иммунизации, либо продуцирующими серовары антигена, нераспознаваемые поствакцинальным иммунитетом. Так, чумные субъединичные вакцины на основе капсульного антигена F1 не способны стимулировать формирование напряженного поствакцинального иммунитета в отношении вирулентных бескапсульных штаммов Y. pestis, а препараты на основе V антигена неэффективны в отношении штаммов, продуцирующих серологически отличающиеся варианты белка [Anisimov et al., 2004]. В тоже время, применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного G. Girard'ом и J. Robic'ом в начале 30-х годов прошлого столетия [Girard, 1963] штамма Y. pestis EV лишена этих недостатков – она не только стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет, но и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [Анисимов, 1999]. Однако следует признать, что на настоящий момент эта вакцина морально устарела, прежде всего, из-за ее высокой реактогенности и способности вызывать тяжелые местные и системные реакции у здоровых вакцинируемых и даже генерализованный инфекционный процесс у лиц со сниженным иммунным статусом [Наумов и др., 1992; Meyer et al., 1974а; Perry, Fetherston, 1997]. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины является одной из важных задач современной системы противочумной защиты населения.



Сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструированы мутанты вакцинного штамма EV с нарушенным синтезом лауриновой кислоты, в которых центральная часть гена lpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [Anisimov et al., 2007]. В серии экспериментов на мышах [Anisimov et al., 2007; Feodorova et al., 2007] и морских свинках [Feodorova et al., 2007] было установлено, что lpxM мутант по сравнению с исходным вакцинным штаммом не только снизил реактогенность, но и обладал повышенной иммуногенностью. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости. Конструирование lpxM мутанта вакцинного штамма EV, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, позволит получить кандидат в вакцинные штаммы Y. pestis - основу для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью и повышенной иммуногенностью.

Цель исследования – разработка способа конструирования кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба с пониженной эндотоксической активностью: получение lpxM производных вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и оценка их в качестве кандидатов в новые вакцинные штаммы.

Задачи исследования:

  1. Разработать способ конструирования lpxM мутантов Y. pestis, лишенных маркеров лекарственной устойчивости, и получить lpxM вариант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ.
  2. Подтвердить корректность введенной мутации с помощью секвенирования сконструированной аллели гена lpxM и определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом.
  3. Провести сравнительную комплексную оценку эндотоксических свойств препаратов ЛПС, синтезируемых родительским и мутантным штаммами.
  4. Оценить биологические свойства кандидата в вакцинные штаммы, включая реактогеннось, безвредность и иммуногенную активность, в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.1113-02 "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба".

Научная новизна.

Впервые сконструирован и охарактеризован в соответствии с методическими указаниями "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба" [2002] lpxM вариант вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости. Установлено, что степень снижения токсичности ЛПС Y. pestis, утратившего шестой жирно-кислотный остаток, зависит от видовой принадлежности клеток – мишеней макроорганизма. Выявлено антагонистическое действие мутантного пентаацильного ЛПС по отношению к ЛПС дикого типа на модели человеческих, но не мышиных фагоцитирующих клеток. Впервые показано, что повышение иммуногенности штамма может сопровождаться снижением его “остаточной вирулентности”

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих lpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез по методике K.A. Datsenko и B.L. Wanner [2000], клонирование мутантной аллели lpxM::cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы: штамм E. coli DH5- pir/pCVD442-lpxM::cat (рег. номер В-6512), продуцирующий суицидный вектор pCVD442-lpxM::cat, штамм E. coli S17- pir/pCVD442-lpxM::cat (рег. номер В-6511), предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора в штаммы чумного микроба. Причем сконструированный штамм может использоваться как донор при создании новых кандидатов в вакцинные штаммы на основе любых аттенуированных штаммов Y. pestis.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонирован авторский штамм Y. pestis EVlpxM (рег. номер В-6513), сочетающий делецию гена lpxM с отсутствием маркеров лекарственной устойчивости (федеральный уровень внедрения).

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций по изучению ингибирующего действия препаратов модифицированного ЛПС Y. pestis на индукцию синтеза TNF- эукариотическими клетками. (Оболенск, 2010, учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту:





1. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости lpxM мутантов Y. pestis – кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.

2. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-. Снижение провоспалительной активности его ЛПС проявляется в большей степени на моноцитах человека и в меньшей степени на макрофагах мыши.

3. Уменьшение реактогенности (остаточной вирулентности) штамма Y. pestis EVlpxM сопровождается повышением его иммуногенности.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 124-Д от 11.06.2009 г. и № 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 годы)».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms – Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (Eilat, Israel, October 25-29, 2009,); VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10 – 11 ноября 2009); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010); Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 8 сентября 2010 года.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях (включая 2 статьи в международных научных журналах реферируемых ISI и 1 главу в международной монографии) список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 42 работу отечественных и 173 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использовали четыре авирулентных штамма Y. pestis и один вирулентный штамм Y. pestis ssp. pestis 231, а также штаммы E. coli: DH5 pir, S17 pir, S17 pir/pCVD442 для проведения генетических манипуляций (МЖК ГНЦ ПМБ). Выращивание штаммов E. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Луриа-Бертани (LB) при температуре 37 °С [Miller, 1972]. Клетки Y. pestis для мутагенеза растили на жидких и плотных питательных средах Хоттингера pH 7,2 -7,4 при 28 °С. Для выделения ЛПС штаммы Y. pestis выращивали с аэрацией при температуре 25 °C в ферментере «New Brunswick Scientific» в жидкой среде на основе солянокислого гидролизата казеина и дрожжевого автолизата.

Конструирование нокаутных мутантов по гену lpxM штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ проводили с помощью прямого сайт-направленного мутагенеза по методике K.A. Datsenko, B.L. Wanner, [2000]. Мутантную аллель lpxM::cat клонировали в суицидный вектор pCVD442, предварительно гидролизованный SmaI. Для удаления кассеты антибиотикоустойчивости использовали плазмиду pCP20.

Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству T. Maniatis et al. [1982]. Передачу рекомбинантных плазмид в штаммы E. coli осуществляли “кальциевым” методом трансформации по S.N. Соhen и A.C.Y. Chang [1973], а в клетки Y. pestis - методом электростимулируемой трансформации [Еремин и др., 1991] и конъюгации [Miller, 1972]

Для определения нуклеотидной последовательности участка хромосомы lpxM штамма Y. pestis EVlpxM использовали прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК.

Выделение ЛПС проводили методом экстракции по C. Galanos [1969]. Электрофоретический контроль препаратов ЛПС проводили по U. Laemmli [1970] и О. Остерману [1985]. Для визуализации ЛПС гели окрашивали аммиачным раствором оксида серебра после окисления йодной кислотой в соответствии с рекомендациями C. Tsai и C. Frash [1982]. Концентрацию белковых примесей определяли по M. Bradford [1976] или O. Lowry [1951]. Содержание нуклеиновых кислот определяли спектрометрически, измеряя оптическую плотность при 260 нм [Wetmur J. Davidson N., 1968], и по окрашиванию препаратов бромистым этидием при электрофоретическом разделении в 0,7 % агарозном геле [Sharp et al., 1973].

Определение структуры полученных препаратов ЛПС проводили с использованием методов спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯРМ) и масс-спектрометрии (МС).

Для определения значений LD50 изучаемых препаратов ЛПС использовали 8-10 недельных мышей линий Balb/C. Животным вводили подкожно пятикратные разведения препаратов ЛПС, растворенных в апирогенном 0,9 % растворе NaCl. Для повышения чувствительности к ЛПС мышей сенсибилизировали подкожным введением раствора актиномицина Д в дозе 10 мкг/мышь одновременно с введением ЛПС.

Основные фенотипические характеристики, культуральные и морфологические свойства вакцинных штаммов Y. pestis определяли в соответствии с методическими указаниями “Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба” [2002].



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.