WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов mycobacterium tuberculosis

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное учреждение науки

государственный научный центр прикладной

микробиологии и биотехнологии

на правах рукописи

Богун Александр Геннадьевич

Использование молекулярно-генетических методов

для комплексного анализа штаммов

Mycobacterium tuberculosis

03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск 2010 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Черноусова Лариса Николаевна

Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Защита состоится 10 декабря 2010 г. в 12 00 на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ПМБ.

Автореферат разослан 08 ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Туберкулёз является главным фактором инвалидизации и смертности, имеющим бактериальную природу [Кононец A.C. и др., 2010; Золотарёва Л.В. и др., 2010]. Эпидемия ВИЧ инфекции привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [Корнилова З.Х. и др., 2010], а распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, создало дополнительные сложности при лечении туберкулёза [Крапина Н.Л. и др., 2010; Drobniewski F. et al., 2005].

Существует множество работ, иллюстрирующих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [Кисличкина A.A., 2009; Lazzarini L. et al., 2008]. Показано, что популяция микобактерий является клональной [Земскова З.С. и др., 2010; Sreevatsan S. et al., 1997]. Для анализа микобактерий используется несколько методов генотипирования, но получаемые результаты часто противоречат друг другу [Supply P. et al., 2006; Gagneux S. et al., 2007; Kremer K. et al., 2005].

Наиболее полная информация о структуре популяции возбудителя туберкулёза, получена, вероятно, в результате анализа 89 генов [Comas Т. et al., 2009]. Необходимость изучения большого количества генов для филогенетического анализа штаммов M. tuberculosis методом мультилокусного секвенирования связана с низким полиморфизмом генома. Это обстоятельство значительно усложняет анализ штаммов и ограничивает применение мультилокусного секвенирования для генотипирования M. tuberculosis.

Другим подходом является анализ полиморфных нуклеотидов, обнаруженных в разных участках хромосомы штаммов M. tuberculosis с полностью идентифицированными геномами [Filliol I. et al., 2006; Gutacker M. et al., 2006]. В результате сравнения последовательностей нуклеотидов в геномах штаммов M. tuberculosis – H37Rv, 1551, 210 и штамме M. bovis AF2122/97 и последующего анализа бактериальных культур, выделенных от пациентов, разработана классификация, позволяющая определить принадлежность штамма к одной из семи групп SCG. Определение точечных мутаций в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПЦР. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет эффективно дифференцировать клинические изоляты микобактерий.

Традиционные методы генетического анализа M. tuberculosis также по ряду причин не являются совершенными. При использовании метода RFLP-IS6110 данные, полученные в разных лабораториях, трудно сравнивать между собой. Сполиготипирование основано на анализе только одного участка хромосомы, который к тому же подвержен конвергентной эволюции, а для метода MIRU-VNTR окончательно не определён набор анализируемых локусов.

Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое выявление штаммов M. tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также обнаружение источников и путей распространения таких штаммов. Наибольшим потенциалом для этих целей обладают молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, так как они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества бактериальной культуры.

Эффективный мониторинг штаммов M. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без наличия единой системы идентификации. Так как в настоящее время все используемые методы генотипирования штаммов M. tuberculosis имеют недостатки, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.

Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует единый алгоритм генетической идентификации штаммов M. tuberculosis. Такой алгоритм должен базироваться на методах, требующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, должен позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.



Цель данной работы – комплексное исследование клинических изолятов M. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.

Задачи исследования.

  1. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом сполиготипирования.
  2. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом RFLP-IS6110.
  3. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом MIRU-VNTR.
  4. Определение принадлежности клинических изолятов M. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.
  5. Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов M. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.
  6. Анализ информативности разных методов генотипирования M. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.

Научная новизна работы. Впервые проведён анализ клинических изолятов M. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования – RFLP-IS6110, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.

Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипических особенностях клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипирования штаммов M. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения конкретных штаммов среди пациентов лечебных учреждений, в том числе штаммов, обладающих лекарственной устойчивостью. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности штамма к индивидуальным филогенетическим группам, что позволяет отслеживать интродукцию штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.

Положения, выносимые на защиту.

1) Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 локусов в геноме туберкулезного микроба.

2) Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов M. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность клинических изолятов к отдельным филогенетическим линиям.

3) Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе проанализированы все клинические изоляты M. tuberculosis (n 330), выделенные от больных с диагнозом туберкулёз лёгких, обратившихся в медицинские учреждения г. Тулы в период с июня 2001 по июнь 2002 г. Для культивирования изолятов M. tuberculosis использовали питательную среду Левенштейна-Йенсена. Выделение ДНК из культуры M. tuberculosis осуществляли методом СТАВ.

На основании анализа литературы для проведения исследования нами выбраны 35 MIRU-VNTR локусов. При их выборе учитывали следующие критерии: 1) наличие локуса в каком-либо широко используемом наборе локусов для MIRU-VNTR типирования; 2) наличие литературных данных о том, что в каком-либо исследовании для данного локуса был обнаружен высокий уровень полиморфизма; 3) длина тандемного повтора должна превышать 40 п.о., что необходимо для анализа ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле. ПЦР проводили на амплификаторе Dyad фирмы Bio-Rad. Размер ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием. Для оценки полиморфизма использовали коэффициент Hunter-Gaston (h) [Hunter P., 1988]. Построение филогенетической схемы для клинических изолятов M. tuberculosis по данным MIRU-VNTR осуществляли с помощью программы Population 1.2.30.





Принадлежность клинических изолятов к геногруппам, идентифицированным на основании SNP-типирования, осуществляли в соответствии с классификацией, предложенной Filliol [Filliol I. et al., 2006]. Для SNP-анализа использовали мультиплексную аллель-специфичную ПЦР [Игнатова A.H., 2007]. Сполиготипирование проводили по стандартной методике [Kamerbeek J. et al., 1997]. Анализ RFLP-IS6110 выполняли в соответствии с van Embden [van Embden J. et al., 1993].

При определении лекарственной устойчивости изолятов M. tuberculosis к стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину использовали метод абсолютных концентраций, в соответствии с приказами минздрава [Приказ № 558, от 8 июня 1978 г.; Приказ № 109, от 21 марта 2003 г.]. Для определения молекулярных механизмов устойчивости к лекарственным препаратам секвенировали гены 16SrRNA, embB, katG, pncA, rpoB, и rpsL. Последовательности фрагментов генов определяли на анализаторе MegaBACE 750 ("Amersham Bioscience", США) согласно инструкциям производителя.

Результаты исследований и их обсуждение

Подбор условий проведения анализа MIRU-VNTR

В работе использовали референсный штамм M. tuberculosis H37Rv и 54 клинических изолята M. tuberculosis, принадлежащих к наиболее распростра-

 а б в Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv по 29-0 а

 б в Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv по 29-1 б

 в Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv по 29 MIRU-VNTR-2 в

Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv по 29 MIRU-VNTR локусам и делеции TbD1:а) Реакционная смесь без дополнительных компонентов (маркер ДНК “50 bp DNA Ladder), б) ПЦР в присутствии 5 % ДМСО (маркер ДНК “O’RangeRuler 50 bp DNA Ladder), в) ПЦР в присутствии 1,5 М бетаина (маркер ДНК “O’RangeRuler 50 bp DNA Ladder”). 1 – маркер ДНК, 2 – ETR A, 3 – ETR B, 4 – ETR C, 5 – MIRU 2, 6 – MIRU 4, 7 – маркер ДНК, 8 – MIRU 10, 9 – MIRU 16, 10 – MIRU 20, 11 – MIRU 23, 12 – MIRU 24, 13 – маркер ДНК, 14 – MIRU 26, 15 – MIRU 27, 16 – MIRU 31, 17 – MIRU 39, 18 – MIRU 40, 19 – маркер ДНК, 20 – TbD1, 21 – QUB-11a, 22 – QUB-11b, 23 – QUB-26, 24 – VNTR 0424, 25 – маркер ДНК, 26 – VNTR 1895, 27 – VNTR 1955, 28 – VNTR 1982, 29 – VNTR 2347, 30 – VNTR 2401, 31 – маркер ДНК, 32 – VNTR 3171, 33 – VNTR 3232, 34 – VNTR 3336, 35 – VNTR 3690, 36 – VNTR 4156, 37 – маркер ДНК.

ненным в РФ геногруппам. Анализ данных RFLP-IS6110 и сполиготипирования позволил сделать заключение о том, что охарактеризованные клинические изоляты не являются смесью нескольких культур M. tuberculosis.

В результате были подобраны условия проведения ПЦР, позволяющие амплифицировать участки ДНК, содержащие тандемные повторы без использования дорогостоящих наборов и полимеразы с горячим стартом. Показано, что наиболее благоприятные условия для ПЦР возникают при добавлении в реакционную смесь ДМСО в концентрации 5% или бетаина в концентрации 1,5М (рис. 1).

Анализ клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR

MIRU-VNTR-анализ клинических изолятов M. tuberculosis (n 330) проводили по 35 локусам. Условия реакции, подобранные для анализа 29 MIRU-VNTR локусов (рис. 1), также позволяют проводить анализ дополнительных шести локусов. Введение в реакционную смесь ДМСО позволило получить данные для всех 330 изолятов по 35 MIRU-VNTR локусам, выбранным для анализа, без использования процедуры горячего старта. Кроме того, использование ДМСО позволило проводить реакцию амплификации при единой для всех локусов концентрации MgCl2 равной 1,5 мМ MgCl2.

При анализе результатов MIRU-VNTR выявлено, что большая часть изученных клинических изолятов M. tuberculosis (n 291; 89 %) являются чистыми культурами; 28 изолятов (8 %) являются смесью нескольких штаммов, поскольку содержат большое количество двойных аллелей; а 11 изолятов (3 %) имеют два аллеля только для одного из локусов. В дальнейшем при сопоставлении информативности разных методов генотипирования мы использовали данные, полученные только для тех изолятов, которые не имеют двойных аллелей (n 291). Количество повторов варьировало от 0 для локусов ETR-F и VNTR 0569 до 28 для локуса VNTR 1895. Всего, при анализе 35 локусов обнаружено 185 профилей MIRU-VNTR: 158 изолятов имеют уникальные MIRU-VNTR профили, а 133 изолята входят в состав 27 кластеров. Индекс разнообразия генотипов MIRU-VNTR (h) равен 0,96.

Пятнадцать кластеров состояли из двух изолятов, шесть кластеров – из трёх изолятов, два кластера – из четырёх изолятов, один – из пяти изолятов, один – из семи изолятов, один – из десяти изолятов и один – из 55 изолятов. Определены индексы полиморфизма (h) для каждого локуса MIRU-VNTR, которые имеют значения от 0 до 0,8 для разных локусов (табл. 1). Таким образом, среди изученных нами локусов оказались локусы как с высоким, так и с низким полиморфизмом.

Таблица 1 - Индексы полиморфизма локусов MIRU-VNTR

Локус

h

Локус

h

Локус



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.