WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шаинидзе Кристина Зурабовна

Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение.

14.00.16 – патологическая физиология

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2009

Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук и на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И. Герцена

Научные руководители:

Академик РАМН

Корнева Елена Андреевна

Д.б.н. проф.

Даринский Ю.А.

Официальные оппоненты:

1. Чернышева Марина Павловна, доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии общей физиологии человека и животных Санкт-Петербургского Государственного Университета.

2. Петрищев Николай Николаевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патофизиологии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова.

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «22» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н. П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий.

В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G. et al., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J.F. et al., 1991; Brenner G.J. and Moynihan J.A., 1997; Glaser, R. Et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., Б.А., 1987; Rybakina E.G. et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.

Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH) ( Peyron C., 1998).

С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi T., 1999; Kurose T. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого разражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха – напротив снижается (Ida T., et al. 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al., 2002; Zhu L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.



Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M., et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru M. et al., 2004; Kurose T., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), а также увеличению количества с-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).

Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Szkely M, 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (PH) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura K. et al 1984; Amir, 1990; Zaretskaia, 2002; Cao 2004, Tanaka, et al 2001). При разных условиях внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Szkely M, 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki T., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина А (Monda M., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi M., 2002).

Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak K., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия.

Целью данной работы явилось изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия – ограничения подвижности и охлаждения.
  2. Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии – ограничении подвижности и охлаждении.
  3. Установить паттерн реакций структур и зон гипоталамуса, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, характерный для проявления ответа мозга на данные виды стрессорных воздействий.
  4. Проанализировать возможные механизмы развития морфо-функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии – ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в 5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.
  2. Изменения иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, после примененных стрессорных воздействий, происходят только в определенных структурах и зонах гипоталамуса крыс, представленных на срезах мозга 29-го уровня.
  3. Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAd на срезах мозга 28-го уровня; в LHAm на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в DMHa, LHAs на срезах мозга 29-го уровня, а также в PH на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга Swanson L.W).
  4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в LHAjd, LHAd, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в PH на срезах мозга 31 уровня.
  5. Картирование орексин-позитивных нейронов в различных структурах гипоталамуса и определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и его сочетании с охлаждением, позволило выявить функциональную дискретность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах гипоталамуса.
  6. Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Научно-практическое значение. Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.





Апробация работы. Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:

  1. Второй Санкт-Петербургский Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» 1 – 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия
  2. 4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня – 3 июля, Санкт-Петербург, Россия
  3. Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 годаб Москва, Россия.
  4. Межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» 13-16 апреля 2008 года.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы Wistar, весом 200-250г. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. I-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: – 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20 минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного) одновременно с экспериментальными.

Для проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени (PCR RT) по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad). Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием набора One Step RT PCR Kit (BioRad). Для проведения реакции использовались праймеры, рассчитанные по программе и произведенные лабораторией «СинТол». Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле. Контроль над ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1». Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и рассчитывали по формуле встроенным программным обеспечением амплификатора.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.