WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера байкал

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЗЕЛЕНКИНА Татьяна Савельевна

Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал

03.00.16 – экология

03.00.07– микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Улан-Удэ

2009

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Дагурова Ольга Павловна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Троценко Юрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ивановский Руслан Николаевич

кандидат биологических наук

Матюгина Евгения Борисовна

Ведущая организация: Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «14» мая 2009 г. в 11.00 на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, биолого-географический факультет, конференц-зал

Факс: (3012) 211593, E-mail: d21202203@mail.ru

tatjana-zelenkina@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Бурятского научного центра СО РАН и Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан «14» апреля 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Метанотрофы и метилобактерии – физиологически и биохимически специализированные подгруппы аэробных прокариот, использующих С1-субстраты в качестве источников углерода и энергии. Метанотрофы и метилобактерии образуют биофильтр, препятствующий поступлению C1-соединений в окружающую среду (Гальченко, 2001). В последние полвека весьма основательно исследованы процессы метанокисления и состав метилотрофных сообществ пресноводных, почвенных и морских экосистем (Hanson, Hanson, 1996; Doronina et al., 2000; Гальченко, 2001; Кравченко и др., 2005; Пименов и др., 2006). Менее изучены метанотрофы и метилобактерии биотопов с высокими значениями температуры (Троценко, Хмеленина, 2008).

Термальные источники являются экстремальными экосистемами, микробные сообщества которых представляют значительный интерес, как для фундаментальных исследований, так и для практического применения (Brock et al., 1971). Ранее из термальных источников Венгрии и Японии были выделены термофильные метанотрофы и изучены их свойства (Bodrossy et al., 1995, 1997, 1999; Tsubota et al., 2005). В Байкальской рифтовой зоне активность и состав метанотрофного сообщества были исследованы эпизодически (Цыренжапова и др., 2007). Разнообразие и биология метилобактерий в гидротермальных экосистемах до сих пор не изучались. В связи с этим актуален анализ состава и активности метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал.

Цель и задачи исследования. Цель работы – исследование разнообразия и активности аэробных метанотрофов и метилобактерий в гидротермах восточного побережья озера Байкал. Для достижения этой цели были поставлены и решались следующие задачи:

  1. Охарактеризовать условия среды обитания микроорганизмов;
  2. Определить общую численность бактерий в грунтах гидротерм;
  3. Определить скорости потребления метана в грунтах гидротерм;
  4. Изучить разнообразие метилотрофных сообществ исследуемых гидротерм;
  5. Выделить чистые культуры метилобактерий и определить их филогенетическое положение.

Научная новизна. Впервые в гидротермах Бурятии исследовано разнообразие и активность аэробных метилотрофных сообществ. На основе сравнительного анализа гена pmoA, методом денатурирующего гель-градиент электрофореза, а также методом флуоресцентной in situ гибридизации установлено, что культивируемое метилотрофное сообщество представлено преимущественно метанотрофами II типа, среди которых преобладают представители рода Methylocystis и Methylosinus. Кроме того, выделены и таксономически охарактеризованы чистые культуры метилобактерий. Установлено, что метилобактерии изученных гидротерм относятся в основном к алкалофильным и нейтрофильным мезофилам рода Bacillus.

Практическая значимость. Полученные данные расширяют наши знания о таксономическом составе метилотрофных сообществ термальных экосистем и создают основу для сравнительных исследований микробных сообществ. Способность выделенных метилобактерий использовать широкий спектр органических соединений может найти применение в биологических способах очистки вод. Результаты данной работы могут быть использованы для оценки экологического состояния гидротерм, а также в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии водоемов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на X Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2007); конференции «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), II Летнем симпозиуме "НОЦ "Байкал" – стратегия развития"; международной конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, 2007), IV Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2007), молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008).



Публикации. По результатам исследования опубликованы 2 статьи и 7 тезисов, 2 статьи находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 109 страницах, включая 13 таблиц и 21 рисунков. Диссертация состоит из разделов “Введение”, «Обзор литературы», «Методы исследований», «Результаты исследований и их обсуждение”, “Заключение”, “Выводы” и “Список литературы”(123 наименований).

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН и в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю - к.б.н. О.П. Дагуровой, научному консультанту - зав. лабораторией метилотрофии, д.б.н., проф. Ю.А. Троценко, зав. лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН, д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву.

Автор признателен сотрудникам лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН к.б.н Б.Ц. Ешинимаеву, д.б.н. В.Н. Хмелениной, к.б.н Н.Е. Сузиной за помощь в работе и доброжелательное отношение. Автор благодарен к.б.н. С.П. Бурюхаеву за помощь в работе, а также всем сотрудникам лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-98018 и 07-04-90814 моб_ст, Программы Президиума СО РАН № 17.9, Минобразования РФ № РНП 2.1.1/2165 и НОЦ «Байкал».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 Местоположение исследованных гидротерм восточного побережья-0

 Местоположение исследованных гидротерм восточного побережья-1

Рис.1.Местоположение

исследованных гидротерм

восточного побережья озера

Байкал

Объекты исследования. Объектами исследования являлись гидротермы Змеиная,

Горячинск и Сухая, расположенные на восточном побережье озера Байкал (рис.1). Выходы этих гидротерм приурочены к тектоническим разломам Байкальской рифтовой зоны. Они относятся к низкоминерализованным щелочным термам. В газовом составе гидротерм Змеиная и Горячинск преобладает азот, в гидротерме Сухая - метан.

Изученные гидротермы характеризуются наличием минеральных ручьев, изливающихся на выходах источников и впадающих в Байкал. Пробы грунтов для исследования отбирали по течению ручья каждого источника в летние периоды 2006 – 2008 гг.

Методы исследования. В местах отбора проб температуру воды измеряли с помощью сенсорного электротермометра Prima (Португалия). pH среды определяли потенциометрически при помощи полевого pH-метра pHep (Португалия). Значение общей минерализации воды определяли портативным тестер-кондуктометром TDS-4 (Сингапур). Концентрацию гидрокарбонатов и карбонатов определяли титриметрическими методами. Содержание сульфатов в воде определяли турбидиметрически, сульфидов – колориметрически (Алекин, 1973; Кузнецов, Дубинина, 1989).

Общую численность микроорганизмов в грунтах определяли путем подсчета бактерий на мембранных фильтрах (Романенко, Кузнецов, 1974) с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore»).

Потенциальную скорость потребления метана в грунтах определяли радиоизотопным методом. В стерильные флаконы вносили по 1 см3 грунтов, заливали 2 мл среды “П” (Гальченко, 2001), разбавленной в два раза («0.5П»), и вносили 14CH4 (0.5-2.0 мкКи, В/О “Изотоп”). Флаконы инкубировали 10 суток при температуре, близкой к температуре in situ. Процесс останавливали добавлением 0.5 мл 10% NaOH. Дальнейшую обработку проб проводили согласно известной методике (Беляев и др., 1975; Sokolov, Trotsenko, 1995).

Численность метанотрофов определяли методом десятикратных разведений, высевая пробы грунтов в жидкую среду «0.5П», с последующей инкубацией с радиоактивно меченным метаном в течение 6-10 дней. О наличии и активности метанотрофов судили по потреблению 14СН4.

Метанотрофные бактерии выращивали на минеральной среде «0.5 П» следующего состава (в г/л): Na2HPO4 – 0.3; KH2PO4 – 0.14; KNO3 – 1.0; MgSO4·7 H2O- 0.2; CaCl2 – 0.02; (в мг/л): ЭДТА Na2 - 5; FeSO4·7H2O - 2; (в мкг/л): ZnSO4·7H2O - 100; MnCl2·4H2O - 30; CuCl2·5H2O - 10; CoCl2·6H2O - 200; NiCl2·6 H2O - 20; Na2MoO4 - 30; H3B03 - 30; вода дистиллированная. Культуры выращивали при 29оС, 37 оС и 45оС.

Культуры метанотрофов выделяли методом истощающего посева. Чистоту культур контролировали микроскопически.

Для получения накопительных культур аэробных метилобактерий использовали среду «М» (Doronina, Darmaeva, 2003) с добавлением 0.2-0.5% NaCl, содержащую (г/л): КН2РО4 – 1.0; KNO3 – 1.0; MgSO47H2O – 0.2 и 1 мл/л раствора микроэлементов (мг): FeNH4-цитрат – 300; CaCl22H2O – 300; MnCl24H2O – 50; ZnSO47H2O – 50; CuSO45H2O – 5; Н2О – 100 мл. После стерилизации в среды вносили 0.5% (об./об.) метанола как источник углерода и 0.05% (об./об.) дрожжевого автолизата в качестве источника витаминов. Культивирование проводили при 29оС, 37оС и 45оС в течение 1-2 недель.

ДНК экстрагировали по методу Мармура (Marmur, 1961), дальнейшую фенольную очистку ДНК проводили, как описано Маниатисом с соавт. (1984). ПЦР-амплификацию проводили на ДНК термоциклере Hybaid (Великобритания) в режиме: 1 цикл – 95°С, 2 мин; 25 циклов – 94°С, 40 с; 56°С (pmoA) и 60°С (16S рДНК), 40 с; 72°С, 40 с; последний цикл – 72°С, 4 мин. Полученные ПЦР-продукты гена pmoA разделяли в полиакриламидном геле с градиентом 35-80% на приборе Dcode, Bio-Rad (США). Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ 2000XL Beckman Coulter (США) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Perkin Elmer», США), согласно инструкциям фирмы-производителя. Транслированные аминокислотные последовательности участков генов pmoA (460 п.н.) и 16S рРНК сравнивали с последовательностями из GenBank, используя программы NCBI BLAST (http// http://ncbi.nlm.nih.gov/Blast ), для выравнивания последовательностей использовали программу Clustal W (версия 1.6). Филогенетическое дерево было построено с использованием программы Treecon W (версия 1.3).





Статистическая обработка данных произведена с помощью программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика исследуемых гидротерм

Температура воды уменьшалась по течению ручьев гидротерм: в Змеиной – от 45оС на изливе до 19оС, в Горячинске – от 51оС на изливе до 16оС, в Сухой – от 41 оС на изливе до 19 оС (табл.1).

Воды гидротерм имеют щелочную реакцию. Значения pH на изливах составляли 9.0-9.4. Окислительно-восстановительный потенциал воды на изливах гидротерм характеризовался отрицательными значениями. Во всех исследованных гидротермах вниз по течению ручья значение pH уменьшалось, тогда как значение Eh увеличивалось.

Таблица 1

Места отбора проб и физико-химическая характеристика гидротерм

Гидротерма Станция и место отбора проб t, оС pH Общая минерализация, г/дм3 Eh, мВ
Змеиная Z1 (излив) 45 9.4 0.3 -100
Z3 (5 м от излива) 40 8.1 0.3 -22
Z6 (зона смешения с водами озера) 19 7.6 0.1 +32
Горячинск G1(излив) 51 9.1 0.4 -0.63
G4 (пруд ) 19 8.0 0.3 +35
G6 (зона смешения с водами озера) 16 7.5 0.2 +103
Сухая C3 (излив) 41 9.0 0.6 -95
С4 (2 м от излива) 38 8.9 0.5 -66
С5 (пруд) 19 8.8 0.5 +137


Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.