WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (solanum lycopersicum l.) на повышение их устойчивости к фитопат

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ХАЛИЛУЕВ МАРАТ РУШАНОВИЧ

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСБ РАСХН).

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук

Сергей Владимирович Долгов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Александр Александрович Соловьев,

доктор биологических наук

Илья Александрович Шилов.

Ведущая организация: Институт общей генетики

имени Н.И. Вавилова РАН.

Защита состоится «_____» 2011 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Тел.: 8 (499) 977 6544; Факс: 8 (499) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru

Автореферат разослан « » мая 2011 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук

Светлана Александровна Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Томат (Solanum lycopersicum L.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продуктов овощеводства как по своему значению, так и по объему производства. По данным ФАО, в 2009 г. томат в России промышленно выращивался на площади 117 тыс. га, а валовой сбор товарной продукции составил около 2,2 млн. т. Высокий спрос на эту культуру обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения целого ряда хозяйственно-ценных признаков и может быть достигнуто как традиционной селекцией, так и методами генетической инженерии. Применение трансгенных форм томата может существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность культуры.

Устойчивость к биотическим стрессам и, в частности, к грибным и бактериальным патогенам – одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томата. Несмотря на достигнутые успехи в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости к неблагоприятным факторам биотической природы по-прежнему остается неразрешенной. Это относится также и к наиболее опасным болезням, таким как фитофтороз.

Прямые потери урожая томата от фитофтороза в годы эпифитотии составляют больше, чем от всех других болезней вместе взятых и в полевых условиях достигают 100%. Фитофтороз приносит значительные экономические убытки в России, особенно в ее Средней полосе, где потери достигают критических величин, а также во многих странах Европы и США. Одной из приоритетных возможностей противостояния фитофторозу томата является получение и последующее промышленное выращивание устойчивых сортов.

В последние десятилетия для повышения устойчивости растений томата к фитопатогенам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в частичном установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечив возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них является привнесение в геном томата чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки и антимикробные пептиды (Broekaert et al., 1997; Edreva et al., 2005; Van Loon et al., 2006).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.), содержащих гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, и оценка влияния экспрессии гетерологичных генов на устойчивость к фитопатогенам.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

  1. получение трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ с генами хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L.;
  2. оценка экспрессии гетерологичных генов в полученных трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ и изучение ее влияния на устойчивость к возбудителю фитофтороза;
  3. изучение характера наследования селективного гена в потомстве трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ;
  4. разработка методики эффективной регенерации и генетической трансформации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены трансгенные растения томата, содержащие гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus (A. caudatus L. и A. retroflexus L.), а также гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. Впервые продемонстрировано влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата на повышение устойчивости к оомицету Phytophtora infestans (Mont.) de Bary. В результате проведенных экспериментов разработана система эффективной регенерации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен с частотой более 85%. Методом агробактериальной трансформации получены растения томата сорта Рекордсмен, экспрессирующие репортерный ген gfp. Полученные экспериментальные данные являются основой для проведения фундаментальных исследований в области изучения механизмов действия белков PR-4 семейства и гевеин-подобных антимикробных пептидов в защитных реакциях растений против фитопатогенов, а также использования вышеперечисленных генов для повышения устойчивости к биотическим стрессам генно-инженерными методами промышленных сортов томата и других представителей рода Solanum.



Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII, IX и XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2009, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень научных изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 21 рисунок. Библиографический список включает 286 источников, из них 259 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. В качестве растительного материала для экспериментов использовали следующие образцы томата: селекционную линию ЯЛФ и промышленный сорт Рекордсмен. Для введения томата в культуру in vitro использовали семена. Стерилизованные семена помещали в культуральные сосуды с питательной средой MS (Murashige and Skoog, 1962), дополненной 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Донорные растения и экспланты культивировали при температуре 23-25С, освещенности 2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь).

Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные векторы. Для проведения экспериментов по генетической трансформации томата применяли следующие обезоруженные супервирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens:

  1. СВЕ21 (Ревенкова и др., 1993) с бинарными векторами pBINmGFP5ER, pBI121ac и pR830;
  2. AGL0 с бинарными векторами pB-AMP1 и pB-AMP2.

В состав Т-ДНК бинарного вектора pBINmGFP5ER входит оптимизированный для экспрессии в растениях ген gfp, содержащий N-концевой сигнальный пептид хитиназы Arabidopsis thaliana и С-концевой пептид HDEL, обеспечивающие локализацию продукта в эндоплазматическом ретикулуме.

Бинарные векторы pBI121ac и pR830 содержат соответственно хитинсвязывающий ген ас из Amaranthus caudatus L. и гибридный ген RS-intron-Shir, кодирующий сигнальную последовательность и первые шесть аминокислот дефензина редьки (Rs) c интроном, а также хитинсвязывающий белок из Amaranthus retroflexus L. (Shir).

Бинарный вектор pB-AMP2 содержит ген amp2, кодирующий лидерный пептид, два гевеин-подобных антимикробных пептида (SmAMP1 и SmAMP2), разделённых спейсером, и С-концевую часть из звездчатки (Stellaria media L.). В отличие от pB-AMP2, несущего полную копию кДНК гена звездчатки, pB-AMP1 содержит ген amp1, кодирующий только лидерную последовательность и один из антимикробных пептидов (SmAMP1).

Все целевые гены находились под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S). Для отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген nptII, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину.

Бинарные векторы с генами хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов сконструированы во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и любезно предоставлены А.А. Гулевичем (pBI121ac), В.Г. Луниным (pR830) и А.В. Бабаковым (pB-AMP1, pB-AMP2).

Регенерация побегов томата. Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН (И.В. Корнеевой, Е.В. Парашиной) были проведены исследования, позволившие оценить регенерационную способность селекционной линии ЯЛФ томата. Было установлено, что оптимальной средой для регенерации побегов томата из семядолей является среда MS, содержащая 5,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ИУК.

Для изучения регенерационной способности томата сорта Рекордсмен в качестве эксплантов использовали семядоли и сегменты гипокотилей длиной 7–10 мм, полученные от асептически выращенных 10-12 дневных проростков. Индукцию органогенеза побегов осуществляли как на базовой питательной среде, составленной по прописи MS (MS0), так и на средах с добавлением различных типов и концентраций регуляторов роста (MS1-MS15) (табл. 1).

Таблица 1.

Состав питательных сред MS для индукции регенерации побегов томата сорта Рекордсмен.

Вариант Вид и концентрация регулятора роста, мг/л
зеатин 6-БАП ИУК НУК
MS0 - - - -
MS1 1,0 - 0,1 -
MS2 1,0 - 0,2 -
MS3 1,0 - 0,5 -
MS4 1,0 - - 0,1
MS5 1,0 - 0,5
MS6 2,0 - 0,1 -
MS7 2,0 - - 0,1
MS8 3,0 - 0,1 -
MS9 4,0 - 0,1 -
MS10 5,0 - 0,1 -
MS11 - 5,0 0,1 -
MS12 - 5,0 - 0,1
MS13 - 2,5 0,1 -
MS14 - 2,5 - 0,1
MS15 1,0 2,5 0,1 -






Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.