WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование синтеза и стабильности амилолитических ферментов мицелиальным грибом aspergillus niger штамм л-4.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КАБАНОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

Исследование синтеза и стабильности амилолитических ферментов

мицелиальным грибом Aspergillus niger штамм Л-4.

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2010 г.

Работа выполнена в Государственном Научном Учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Комов Вадим Петрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Шлейкин Александр Герасимович

доктор медицинских наук, профессор

Денисенко Александр Дорофеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт эволюционной физиологии

и биохимии им. И.М.Сеченова

Защита состоится «01» июля 2010 года в 11 часов на заседании совета Д 001.022.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.

Автореферат разослан «….»……………….2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.В. Пучкова

Доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в пищевой биотехнологии одно из первых мест занимает производство лимонной кислоты из различных сырьевых источников. Ранее традиционно в качестве таковых использовали сахарозу или мелассу, однако в настоящее время наметился переход к использованию недорогого и технологичного крахмалсодержащего сырья.

Лимонная кислота (цитрат) синтезируется и используется в митохондриях в качестве энергетического субстрата. Кроме того, она играет существенную роль в образовании цитозольного ацетил–КоА.

Микробные клетки, как и клетки растений и животных, в физиологических условиях не синтезируют избытки метаболитов. Однако, изменение условий культивирования или соотношения индукции /репрессии генов в геноме клетки приводит к накоплению ряда метаболитов не только не вовлекающихся в реакции обмена веществ, но и мешающие нормальной жизнедеятельности. Клетки стараются избавиться от избытка такого рода метаболитов и элиминировать их в экстрацеллюлярное пространство.

Этот процесс, называемый сверхсинтезом того или иного метаболита, широко используется в биотехнологии для получения целевых продуктов, имеющих промышленное значение. К таким продуктам относится, в частности, лимонная кислота, получаемая в настоящее время с помощью мутантных штаммов грибов Aspergillus niger.

Продуценты лимонной кислоты существенно отличаются от исходных, нативных штаммов по генетическим, молекулярно-биологическим и биохимическим характеристикам и, прежде всего по функционированию цитратсинтезирующей и цитратэлиминирующей систем. Во ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН путем мутагенеза и вегетативной гибридизации был получен ряд штаммов Aspergillus niger - продуцентов лимонной кислоты, в том числе и промышленный штамм Л4.

При инкубировании продуцента на среде с сахарозой или мелассой глюкоза свободно проходит в клетку и вовлекается в процесс гликолиза. Иная картина наблюдается при переходе на среду с крахмалом, который не способен преодолеть клеточную мембрану.

Для его конверсии продуцентом в лимонную кислоту происходит экспрессия амилолитических ферментов – альфа- и глюкоамилаз, которые секретируются во внеклеточное пространство и гидролизуют крахмал до моно- и олигосахаридов. Альфа-амилаза (эндофермент) гидролизует внутренние гликозидные связи полисахаридной цепи, приводя к образованию молекул олигосахаридов различной длины; глюкоамилаза (экзофермент) – отщепляет моносахариды от конца углеводного полимера, в результате чего выделяется, глюкоза.

Этим ферментам посвящено множество работ, но такие их свойства, как скорость секреции во внеклеточное пространство, стабильность и механизмы распада внутри и вне клетки, а также сравнительная оценка нативных и индуцированных субстратом амилолитических ферментов до сих пор в литературе не описаны. Подобные исследования имеют большое теоретическое значение и, при этом, практически важны, так как позволяют осуществлять мониторинг жизнедеятельности продуцента и его биосинтетической способности.

Целью нашей работы было изучение механизмов синтеза и контролируемого распада внутриклеточных и секреторных глюкоамилазы и альфа-амилазы, скорость их секреции во внеклеточное пространство, а также влияние субстрата на индукцию синтеза этих ферментов. В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:

  1. Изучить закономерности изменения активности альфа и глюкоамилаз в процессе культивирования гриба-продуцента.
  2. Получить высокоочищенные нативные и меченые тритием амилолитические ферменты исследуемого штамма, а также моновалентные антитела к ним.
  3. Определить количественные характеристики синтеза и распада амилолитических ферментов in vivo, а также механизмы и скорость их секреции во внеклеточное пространство.
  4. Провести сравнение количественных показателей кинетики и обмена внутриклеточной и секреторной альфа- и глюкоамилаз.
  5. Изучить закономерности индукции синтеза глюкоамилазы основным субстратом.

Положения, выносимые на защиту.



  1. Исследуемая глюкоамилаза легко выделяется из смеси с другими белками путем препаративного электрофореза в ПААГ с сохранением ферментативной активности.
  2. Аминокислотный состав и молекулярная масса глюкоамилазы промышленного штамма Л4 мицеллиального гриба Aspergillus niger существенно отличаются от таковых для фермента из аналогичных природных штаммов.
  3. Кинетические свойства и параметры метаболизма исследованных секреторной и внутриклеточной глюкоамилаз различны, что позволяет говорить об их биологической самостоятельности.
  4. Синтез как секреторной, так и внутриклеточной глюкоамилаз значительно возрастает при добавлении в питательную среду раствора крахмала.

Научная новизна полученных результатов

-Впервые дана всесторонняя характеристика метаболизма амилолитических ферментов, участвующих в формировании энергетического потенциала гриба Aspergillus niger.

-Разработан новый, эффективный лабораторный метод получения гомогенной глюкоамилазы при помощи препаративного электрофореза в ПААГ.

-Впервые исследованы кинетические параметры внеклеточной и внутриклеточной глюкоамилаз, проведена их сравнительная характеристика.

-Установлен факт индукции синтеза глюкоамилазы под действием ее основного субстрата - крахмала. Определены количественные показатели этого процесса.

-Впервые для данного промышленного штамма определен аминокислотный состав секреторных альфа- и глюкоамилаз.

Научно - Практическое значение.

Теоретические аспекты работы связаны, в первую очередь с исследованием метаболизма амилолитических ферментов в Aspergillus niger. Результаты исследования дополняют существующие представления о механизмах углеводного обмена грибов.

Практическая значимость работы определятся возможностью контроля синтеза ферментов связанных с получением одного из наиболее ценных продуктов пищевой биотехнологии – лимонной кислоты.

Личный вклад соискателя.

Соискателем были получены гомогенная глюкоамилаза и антитела к ней. Проведена сравнительная оценка кинетических параметров внутриклеточных и секреторных форм амилолитических ферментов, оценка синтеза, стабильности и скоростей секреции альфа- и глюкоамилаз в экстрацеллюлярное пространство. Впервые достоверно установлен эффект индукции глюкоамилазы крахмалом.

Апробация работы.

Часть результатов были доложены на конференции-школе «Формирование конкурентоспособности молодых ученых» (Санкт-Петербург - Пушкин, 26 октября 2006 года).

Структура и объем работы. Текст диссертации изложен на 93 страницах, иллюстрирован 8 таблицами, 31 рисунком. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, экспериментальных данных, их обсуждение, выводов и списка литературы, содержащего 122 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования и методы культивирования. Объектом исследования являлся промышленный продуцент лимонной кислоты гриб Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 (Л4) из коллекции ГУ ВНИИПАКК. Культивирование продуцента проводили по разработанной в ГУ ВНИИПАКК технологии лимонной кислоты и амилолитических ферментов, позволяющей в одном технологическом процессе получать лимонную кислоту и комплексный ферментный препарат, который обладает амилолитической активностью (альфа-амилазной и глюкоамилазной) [Шарова и др., 2001].

Для исследований использовали мицелий и нативный раствор, полученный после фильтрации культуральной жидкости по действующей технологии.

Получение цитозольной фракции мицелия проводили с помощью дезинтегратора HSF (Англия) в течении 6-8 минут при амплитуде 7 микрометров, смешав биомассу с буферным раствором (рН 4,7) в соотношении 1:10. Далее супернатант отделяли от осадка с помощью центрифугирования при 20000 g и температуре +4°С в течении 20 минут либо при 8000 g в течении 30 минут и той же температуре. Определение количественного содержания белка в супернатанте, использовавшемся для дальнейших исследований, проводилось по методу [Loury, 1951].

Определение активности изучаемых ферментов проводилось по методикам, опубликованным в книге Рухлядевой А.П, Полыгалиной Г.В., (1981). Субстратом служил растворимый крахмал. Активность альфа-амилазы рассчитывалась по убыванию концентрации крахмала, активность глюкоамилазы – по нарастанию содержания глюкозы в реакционной смеси.

Получение ультраконцентрата гидролитических ферментов. Мицелий гриба-продуцента отделяли от раствора ферментов (имеющего альфа-амилазную и глюкоамилазную активность) при температуре не более 32°С. Данный раствор при аналогичной температуре очищали с помощью фильтрующего или сорбирующего средства, при этом использовали мембрану с диаметром пор 0,65 мкм или суспензию бентонита, или углеволокнистый материал Карбопон актив. Затем грубо очищенный ферментный раствор разделяли ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000 Да, на раствор кислотостабильных амилолитических ферментов и раствор лимонной кислоты. Полученный ультраконцентрат являлся основой для тонкой очистки обоих ферментов.





Получение гомогенной глюкоамилазы Метод электрофореза: использовали вертикальный 7,71% полиакриламидный гель. В каждую лунку наносили 80-120 мкг белка, сила тока составляла 25 мА, длительность процесса - 4 часа. Далее из геля вырезали продольные полосы в соответствии с Rf выделяемых белков и в течении суток проводили элюцию ацетатным буферным раствором (рН 4,7).

Кроме того гомогенную глюкоамилазу получали методом гель-хроматографии.

Получение гомогенной альфа-амилазы из ультраконцентрата осуществляли методом аффинной хроматографии, используя в качестве носителя нативный крахмал, уравновешенный буферным раствором трис-хлорида (0,05 моль/л, рН 6,5), а в качестве элюента – тот же буферный раствор с добавлением гликогена до массовой доли 0,4 %.

Получение антисыворотки к глюкоамилазе проводилось по методике, разработанной в Санкт-Петербургской Химико-Фармацевтической Академии [Troitskaya et al., 1999]. Аналогичным путем получали иммунную сыворотку к альфа-амилазе.

Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле. Данное исследование проводилось по модифицированному методу Oхтерлони[Остерман, 1983] в 1% агаре Дифко.

Электрофорез в вертикальном 7,5% геле. Процесс проводили при 4С в аппарате для вертикального электрофореза производства р/к Хийу Калур (Эстония) по методу [Devis, 1964].

Определение параметров обмена белков. Меченный 3Н-лейцин в составе раствора этилового спирта с массовой долей 50 % и содержанием DL [2,3-3H] -лейцина 4,5 мКи/см3 стерильно вводили в культуру гриба Aspergillus niger из расчета 1 мКи на 50 см3 посевного материала и при 100-кратном избытке немеченого лейцина во избежание реутилизации радиоизотопа. Белок осаждали из культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой. Преципитаты получали смешением антисыворотки и культуральной жидкости в соотношении 1:1 с последующей инкубацией в холодильнике на протяжении 7-10 суток. Остаточную радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике Liquid scintillation counter 1209 RACKBETA фирмы WALLAC в белке и в преципитатах антиген – антитело, полученных из культуральной жидкости после 1-5 суток ферментации. Константы скорости синтеза (Кs) и распада (Кd) индивидуальных белков-ферментов определяли по методу Shimke R.T., (1973), время полураспада Т1/2 – по методу Arias I.M., (1969). Концентрацию общего белка определяли по Лоури, а параметры его оборота как описано выше для индивидуальных ферментов.

Определение аминокислотного состава белков. Лиофилизированные образцы белков помещали в ампулы с добавлением триптамина и метансульфоновой кислоты; продували ампулы азотом, охлаждали, запаивали, затем выдерживали 22 часа при температуре 110С. После охлаждения ампулу вскрывали, добавляли к содержимому 3,5 М раствор гидроксида натрия и проводили анализ белкового гидролизата с помощью аминокислотного анализатора Alpha Plus LKB Biochrome. Количественное содержание аминокислот в гидролизате определяли по площади хроматографических пиков в сравнении с пиками калибровки.

Исследования индукции синтеза глюкоамилазы проводили при глубинном культивировании Aspergillus niger в колбах Эрленмейера вместимостью 750 см3 на встряхивающем аппарате АВУ-50Р с частотой колебаний 160±5 мин-1.

Посевной мицелий выращивали на сахарозо-минеральной среде с добавлением в качестве стимулятора роста свекловичной мелассы. Исходная концентрация сахара в питательной среде составила 50,0±0,5 г/см3 периодическим способом с дробным введением гидролизата крахмала до суммарной концентрации сахара в среде 140 г/дм3. Продолжительность ферментации равнялась 5,0 суткам.

Статистическая обработка результатов эксперимента проводилась с использованием критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при Р0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.