WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование изменения активности рнказ пресноводного ­моллюска viviparus viviparus l. под воздействием техногенных загрязнителей.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ФИЛКОВ ПАВЕЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

Исследование изменения активности РНКаз

пресноводного ­моллюска Viviparus viviparus L. под воздействием

техногенных загрязнителей.

03.02.08 экология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии

Московского педагогического государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Коничев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Васильев Андрей Валерьевич

кандидат биологических наук,

доцент

Проскурина Ирина Константиновна

Ведущая организация: Московский государственный

гуманитарный университет имени М.А. Шолохова

Защита диссертации состоится « » _______________ 201  г. в « » ч на заседании диссертационного совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, МО, Мытищи, ул. Веры Волошиной, 24; http://mgou.ru .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского

государственного областного университета по адресу: 105005, Москва,

ул. Радио, д. 10а.

Автореферат разослан « » _______________ 201  г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук,

доцент Снисаренко Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одной из наиболее актуальных проблем современности является техногенное загрязнение окружающей среды. Увеличение содержания в воде загрязняющих веществ, в частности тяжелых металлов, представляет угрозу для жизнедеятельности водных экосистем (Подгурская О.В., 2006). Оценка качества водного объекта физико-химическими методами не раскрывает всей полноты взаимодействия между собой компонентов водной среды. Мировой тенденцией в биотестировании является использование водных моллюсков в качестве биоиндикаторов, так как они обладают рядом преимуществ перед остальными видами тест-объектов (Цветков И.А. и др., 1997; Rainbow P.S., Phillips D.J., 1993; Boening D.W., 1999).

В настоящее время разработано множество систем биотестирования, основанных на количественных показателях выживаемости, смертности, плодовитости тест-объектов, однако, в то же время, существует относительно мало систем биотестирования с клеточными и субклеточными маркерами. В частности, рекомендуется определять уровни металлотионеинов в тканях двустворчатых моллюсков для оценки концентраций тяжелых металлов в среде (Boening D.W., 1999; Fishelson L. et al., 1999; Boisson F. et al., 1998; Regoli F., Orlando E., 1999; Hung T.C. et al., 2001), однако, для оценки воздействия органических загрязнителей подобных маркеров не до сих пор не предложено.

Группой исследователей (Hauser M.J.B., Olsen L.F., 1996; Olsen L.F., Hauser M.J.B., Kummer U., 2003) ранее было предложено использовать неспецифические реакции адаптации организма к изменившимся условиям окружающей среды, выраженные в изменении активности и фракционного состава молекулярных форм кислых гидролаз. В частности, был использован пресноводный брюхоногий моллюск Viviparus viviparus L., ферментные комплексы которого демонстрировали изменение активности неспецифического характера в ответ на воздействие тяжелых металлов и загрязнителей органической природы (Попов А.П., 2002). На этом же объекте ранее был установлен неспецифический характер изменения активности фосфатаз в ответ на воздействие техногенных загрязнителей (Цветков И.А., 1998; Цветков И.А. и др., 1997). До настоящего времени подобных исследований, охватывающих метаболизм РНК и активность РНКаз данного моллюска не проводилось. Принимая во внимание специфику данной группы ферментов, можно предположить наличие значительной адаптивной реакции на воздействие загрязнителей, что делает актуальным изучение метаболизма РНК и активности РНКаз моллюска в условиях воздействия сублетальных и летальных концентраций загрязнителя.

Цель исследования состояла в изучении изменения активности рибонуклеаз и фракционного состава РНК пресноводного моллюска V. viviparus, под воздействием сублетальных и летальных концентраций загрязняющих веществ органической и неорганической природы в модельных растворах и в загрязненной воде из природных водоемов.

Задачи исследования.

  1. Охарактеризовать комплекс РНКаз моллюска V. viviparus в естественных условиях: установить значения рН среды, соответствующие максимальной активности РНКаз в ткани пищеварительной железы и в мышечной ткани; изучить состав множественных форм РНКаз; охарактеризовать сезонные колебания активности РНКаз; выделить и изучить фракционный состав препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска; исследовать физико-химические свойства кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска.
  2. Охарактеризовать изменения активности рибонуклеаз пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием сублетальных и летальных концентраций различных загрязнителей (ионов ртути (II); кадмия (II); свинца (II); меди (II); трихлорметана; симм-тетрахлорэтилена; тетрахлорметана; фенола; бензина; ПАВ (синтанол ДС-10; неонол АФ-9-4).
  3. Выявить изменения фракционного состава препарата тотальной РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus под воздействием летальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II).
  4. Выявить изменения в наборе форм кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска под воздействием сублетальных концентраций тетрахлорметана, хлороформа и тетрахлорэтилена.
  5. Исследовать изменения активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска под воздействием загрязненной воды из природного водоема; установить концентрации загрязнителей в воде физико-химическими методами и рассчитать корреляцию результатов анализа и биотестирования.

Научные результаты, выносимые на защиту.



  1. Изменение активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска происходит под воздействием загрязнителей, содержащихся в модельных растворах и в загрязненной воде природного водоема и имеет вид неспецифических волнообразных изменений, схожих у различных токсикантов.
  2. Воздействие летальных концентраций ионов ртути (II) и кадмия (II) приводит к необратимым изменениям метаболизма РНК, характеризующимся изменением соотношения основных фракций, образованием низмолекулярных фрагментов и исчезновением высокомолекулярных фракций РНК (28s РНК). Воздействие сублетальных концентраций хлорорганических углеводородов, провоцирующее образование свободных радикалов, вызывает изменение активности определенных форм кислой РНКазы и появление новых форм фермента с ОЭП 0,20 и 0,45.
  3. Основные фракции РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus соответствуют фракциям 28s и 18s РНК печени крысы. Молекулярная масса кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска находится в диапазоне 14 – 18 кДа.

Научная новизна. Впервые охарактеризована удельная активность РНКазы в ткани пищеварительной железы и в мышечной ткани пресноводного моллюска V. viviparus, имеющая сезонные колебания (6,47 х 10-3 ± 1,1 х 10-4 у.е. летом и 2,55 х 10-3 ± 2,6 х 10-4 у.е. зимой); установлено значение рН 4,6, соответствующие максимальной активности фермента; множественные формы кислой РНКазы с ОЭП 0,35, 0,50 и 0,70; приблизительная молекулярная масса фермента 14-18 кДа.

Выделен и изучен препарат тотальной РНК пищеварительной железы моллюска V. viviparus, охарактеризован фракционный состав и молекулярная масса ее основных фракций.

Показано неспецифическое изменение активности кислой РНКазы под воздействием in vivo загрязнителей различной природы; изменение фракционного состава и активности множественных форм кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска.

Показана разница в изменении метаболизма РНК пищеварительной железы моллюска под воздействием летальных концентраций токсикантов, что свидетельствуют о различных предполагаемых механизмах действия загрязнителей на субклеточные системы.

Показана положительная корреляция между изменением активности кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска и содержанием в воде загрязняющих веществ.

Разработан метод выявления множественных форм РНКазы (моллюсков), характеризующийся, по сравнению с ранее известными методами, более четкими результатами.

Теоретическая значимость. Впервые выделены и охарактеризованы препараты тотальной РНК и кислой РНКазы пищеварительной железы моллюска V. viviparus, что дает представление об их метаболизме в организме пресноводного моллюска; показана высокая чувствительность и неспецифическая природа изменения активности кислой РНКазы пищеварительной железы пресноводного моллюска V. viviparus (маркера) под воздействием различных загрязняющих веществ органической и неорганической природы, что может быть положено в основу методики интегральной скрининговой оценки качества водного объекта.

Практическая значимость. Использование неспецифических внутриклеточных маркеров, таких как кислая РНКаза пищеварительной железы моллюска, позволяет создать универсальный скрининговый метод контроля состояния водного объекта, характеризующийся высокой степенью интегральности оценки качества водного объекта.

Полученные экспериментальные данные можно использовать при разработке учебного курса «Экотоксикология» или «Экологическая биохимия».

Апробация работы. Результаты исследований были представлены в виде тезисов, пленарных и стендовых докладов за период с 2004г. по 2008г. на российских и международных симпозиумах и конференциях: IV сессия международной Постоянно действующей конференции «Эволюция инфосферы», круглый стол «Экология и город» (Москва, 2004); Международный конгресс по отходам «Waste-Tech 2005» (Москва, 2005); Международная конференция «Analytica-Expo 2006» (Москва, 2006); Конференция РАЕН «Региональные и муниципальные проблемы устойчивого развития территорий» (Москва, 2006); Седьмой международный конгресс «Вода: экология и технология» (Ecwatech – 2006) (Москва, 2006); Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология – современные биоаналитические системы, методы и технологии». (Пущино-Тула, 2006); V сессия международной Постоянно действующей конференции «Эволюция инфосферы», часть первая, круглый стол «Экология и город» (Москва, 2007).





Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ (1 в печати), из них 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 4 статьи в материалах международных, всероссийских и других конференций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и содержит 36 таблиц, 39 рисунков, 3 приложения. В списке литературы 235 источников, в том числе 205 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. Коничеву А.С., а также сотрудникам кафедры Органической и биологической химии МПГУ д.б.н. Кутузовой Н.М., д.б.н. Егоровой Т.А., д.б.н. Севастьяновой Г.А., д.б.н. Клуновой С.М., к.б.н. Иванову В.Г., к.б.н. Пиунковой С.А. за консультации и советы в проведении эксперимента. Автор выражает глубочайшую признательность д.м.н., проф. Осипенко М.Ф. и Осипенко С.М. за поддержку и конструктивные советы при написании этой работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Биотестирование с использованием моллюсков. Современное представление о рибонуклеазах. Приведены данные литературы о тенденциях развития и потенциале применения методов биотестирования на практике; рассмотрена специфика воздействия на организм морских и пресноводных моллюсков различных загрязнителей, биохимические процессы, сопряженные с реакциями их детоксикации; обобщены современные представления о рибонуклеазах, их строении, свойствах, приведены системы классификации и области применения.

Глава 2. Материалы и методы исследований. После экспонирования моллюска в растворе токсиканта методом вивисекции извлекали пищеварительную железу, которую промывали 0,15М раствором хлорида натрия, взвешивали и гомогенизировали с трех-пятикратным объемом 0,15М хлорида натрия в гомогенизаторе Поттера. Гомогенат центрифугировали при охлаждении и 6000g в течение 15 минут, в супернатанте определяли содержание белка по методу Лоури (Lowry O.H. et al., 1951). Определение активности РНКазы проводили по методу Рассела (Razzel W., Khorama H., 1961). Для определения множественных форм фермента использовали электрофорез в ПААГ по методу Дэвиса (Davis J.R., 1964) с мягким дегидратированием 85% этанолом и последующим регидратированием инкубационным буфером, содержащим субстрат РНК, переносом пластины в чистый инкубационный буфер, инкубированием, остановкой реакции, окраской горячим раствором метиленового синего и отмывкой горячей дистиллированной водой. Электрофорез тотального белкового препарата проводили в денатурирующих условиях по Лэммли (King J. and Laemmli, 1971) и в неденатурирующих условиях по Дэвису (Davis J.R., 1964). Окрашивание электрофореграмм тотального белкового препарата, проведенных в денатурирующих условиях проводили Кумасси-R250, в неденатурирующих условиях – коллоидным серебром. При необходимости, пластины геля с электрофореграммами высушивали, дегидратируя ацетоном.

Выделение РНК из пищеварительной железы моллюска проводили классическим фенол-хлороформным методом с гуанидилтиоцианатом в качестве ингибитора РНКаз, выделение РНК из печени крысы проводили аналогично. Электрофорез РНК проводили в ПААГ с последующей окраской горячим раствором метиленового синего и отмывкой горячей дистиллированной водой. Пластины ПААГ фотографировали на столике трансиллюминатора и обрабатывали на компьютере в программе «Phoretix 1D».

Выделение кислой РНКазы проводили методом гель-фильтрации через сефадекс G-75 fine с последующим десятикратным концентрированием полиэтиленгликолем.

Глава 3. Характеристика метаболизма РНК и активности РНКаз пресноводного моллюска V. viviparus в отсутствие техногенных загрязнителей. В главе приведены экспериментально полученные данные о метаболизме РНКаз и РНК пищеварительной железы моллюска. Выбор этого органа для эксперимента был сделан из-за интенсивных процессов метаболизма (Розенгарт Е.В. и др., 1993; Цветков И.Л., 1998), гемопоэза (Avanesyan A.V., Ataev G.L., 2004), простоты его препарирования и локализации процессов детоксикации ксенобиотиков (James M.O., 1982; Руденко C.C., Морозова T.B., 2008, Попов А.П. и др., 2003).

Установлено, что фермент обладает нуклеолитической активностью по отношению к высокополимерной дрожжевой РНК в кислом диапазоне рН с выраженным оптимумом рН 4,6 (рис. 1).

Выявлено, что удельная активность кислой РНКазы (опт. рН 4,6) в мышечной ткани почти в 3 раза ниже, чем в пищеварительной железе: (2,03 ± 0,54) х 10-4 у.е. и (6,15 ± 0,67) х 10-4 у.е. соответственно.

Рис. 1. Изменение активности РНКазы пищеварительной железы моллюска в зависимости от рН среды инкубации.


Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.