WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Семейный анализ генетической предрасположенности к рассеянному склерозу

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МАКАРЫЧЕВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

СЕМЕЙНЫЙ АНАЛИЗ

ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ

К РАССЕЯННОМУ СКЛЕРОЗУ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Москва.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент, Международный биотехнологический центр «Генериум» Марина Анатольевна Судомоина
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития, г. Москва. Ольга Олеговна Фаворова
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов»,
г. Москва.
Носиков Валерий Вячеславович
кандидат биологических наук,
ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития, г. Москва.
Белогуров Анатолий Александрович
Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва

Защита состоится « » 2012 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (РС) представляет собой тяжелое воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), приводящее к инвалидизации. Поражая преимущественно молодых работоспособных людей, РС представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. В России частота РС составляет от 30 до 70 человек на 100000 населения (Гусев и др., 2004).

Согласно современным представлениям, патогенез РС во многом определяется иммуно-опосредованными механизмами (Kalman et al. 2002, Угрюмов, 2010). Хотя его этиология до настоящего времени остается неизвестной, РС относят к типичным комплексным заболеваниям, в развитие которых большой вклад вносит наследственная предрасположенность с неменделевским полигенным типом наследования, на основе которой действуют остальные факторы риска (Zhang et al., 1997; Dyment et al., 2004). Сложность взаимодействий внешних и генетических факторов предрасположенности не позволяет однозначно предсказать возникновение РС исходя из отдельно взятого признака, однако выявление даже ограниченного эффекта того или иного гена на развитие или характер течения РС может способствовать пониманию биологической природы заболевания и открыть новые возможности для его профилактики и лечения. Несмотря на многочисленные усилия исследователей, вопрос о факторах генетической предрасположенности к РС далек от своего разрешения. Для идентификации генов, определяющих предрасположенность к РС, в настоящее время используют две основные стратегии: выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиологии и патогенезе заболевания (в первую очередь, в аутоиммунных процессах), и полный геномный скрининг с использованием больших панелей генетических маркеров, равномерно распределенных по геному. Часто в этих исследованиях наблюдается низкая воспроизводимость результатов, которую связывают, наряду с этническими различиями между рассматриваемыми в разных исследованиях группами индивидов, с искажением результатов вследствие этнической гетерогенности больных и здоровых в одном исследовании, а также с влиянием факторов окружающей среды (Hattersley et al., 2005).

Чтобы исключить влияние этнической неоднородности сравниваемых групп больных и неродственных здоровых, разработаны различные подходы, основанные на анализе семейного материала. Один из них – полный геномный поиск областей генома, сцепленных с РС – оказался подходом недостаточно информативным, вследствие его низкой чувствительности (Risch, 2000). В настоящей работе для анализа ассоциаций использован метод семейного анализа, AFBAC (affected family-based control), в котором контрольную группу составляют из тех аллелей здоровых родителей, которые не передаются больным потомкам (Beck et al., 1988; Thomson 1995). Кроме того, нами для анализа как ассоциации, так и сцепления использован метод неравновесной передачи аллелей (transmission disequilibrium test, TDT) (Terwilliger 1995; Spielman et al., 1996), в основе которого лежит анализ случаев передачи маркерного гаплотипа от гетерозиготных родителей больным детям. Этот метод позволяет исключить не только влияние этнической неоднородности сравниваемых групп больных и неродственных здоровых, но и, в определенной степени, влияние факторов окружающей среды, и является более чувствительным, чем полный геномный поиск на семейном материале (Spielman et al., 1993).



Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является семейный анализ генетической предрасположенности к РС как к полигенному иммуно-опосредованному заболеванию. На материале ядерных семей русской этнической принадлежности проведен анализ вклада в предрасположенность к РС полиморфных участков следующих генов иммунной системы: HLA-DRB1, CTLA4, IFNG, IL6, TNF, TGFB1, IL4, CCR5, RANTES, а также генов, кодирующих белки, участвующие в проникновении активированных лимфоцитов через ГЭБ, – матриксную металлопротеиназу 9 (MMP9) и тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP1).

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие конкретные задачи:

– Провести геномное типирование функционально значимых полиморфных участков гена 1 бета-цепи человеческого лейкоцитарного антигена DR (HLA-DRB1), гена антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), генов интерферона- (IFNG), интерлейкина-6 (IL6), фактора некроза опухоли (TNF), трансформирующего фактора роста-бета 1 (TGFB1), интерлейкина-4 (IL4), гена рецептора CC-хемокинов-5 (CCR5), гена хемокина, регулируемого при активации, экспрессируемого и секретируемого нормальными Т-клетками (RANTES, или CCL5), гена матриксной металлопротеиназы-9 (MMP9) и гена тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (TIMP1) для неродственных больных РС и их здоровых родителей, русских по этнической принадлежности.

– Определить частоты аллелей, частоты встречаемости аллелей и частоты генотипов исследованных генов для русских больных РС и их здоровых родителей.

– Провести семейный анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием РС с помощью метода AFBAC (affected family-based control), в котором контрольная группа составлена из аллелей, не перенесенных от родителей больным детям.

– Провести семейный анализ сцепления и ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием РС с помощью метода неравновесной передачи аллелей (TDT).

Необходимой предпосылкой подобной работы является правильная постановка диагноза неврологического заболевания при формировании группы больных РС. Отбор больных с диагнозом "РС" по принятым на настоящий момент для этого заболевания критериям Макдональда (McDonald et al., 2001) и последующие клинические наблюдения осуществлялись в Научном центре здоровья детей РАМН и в Московском городском центре РС (ГКБ № 11).

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящем исследовании впервые исследовали гены IFNG, IL6, IL4, RANTES, MMP9 и TIMP1 как кандидаты на роль факторов риска РС у этнических русских. Впервые проведен анализ на семейном материале ассоциации и сцепления аллелей однонуклеотидных полиморфизмов этих генов и генов CTLA4, TNF, TGFB1 и CCR5, а также всех анализируемых аллелей мультиаллельного полиморфизма гена HLA-DRB1 с РС у русских. Настоящая работа представляет собой целостное систематическое исследование вклада функционально значимых полиморфных участков 11-ти генов воспалительного и иммунного ответа в развитие РС у русских.

Впервые на семейном материале методом TDT выявлены одновременно сцепление и ассоциация с РС аллеля TNF*(–308)A и аллеля MMP9*(–1562)C у этнических русских. С помощью этого метода наблюдали также сцепление и ассоциацию с РС группы аллелей HLA-DRB1*15 у русских и тем самым валидировали (реидентифицировали) результаты, полученные ранее на независимой выборке меньшего размера (Boiko et al., 2002).

Полученные нами методом TDT результаты, свидетельствующие об ассоциации с РС аллеля TNF*(–308)A и группы аллелей HLA-DRB1*15, были подтверждены в независимом анализе методом AFBAC.

Выявление ассоциированных с РС полиморфных участков в будущем будет способствовать идентификации предрасположенных к этому заболеванию людей еще до заболевания и принятию адекватных мер профилактики.

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы; она изложена на 131 странице, включает 10 рисунков и 26 таблиц. Список литературы содержит 316 источников.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины" (Москва, 2008), на международной конференции Proceedings of HGV-2009 (Таллин, 2009). Работа была апробирована на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития 3 ноября 2011 года и на заседании секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 15 ноября 2011 г.





Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 3 материала конференций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные реактивы. В работе использовали Taq-полимеразу и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ЗАО "Силекс", Россия); олигонуклеотиды и маркер молекулярной массы ДНК pUC19/Msp I (НПО "СибЭнзим", Россия); эндонуклеазы рестрикции, (НПО "СибЭнзим", Россия, если не указано иначе); протеиназу K, SDS (додецилсульфат натрия) ("AppliChem", Германия); моноклональные антитела к Taq-полимеразе, Taq-Start (АО "Мона", Россия); ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) ("Merck", Германия); Tris, NP-40 ("Sigma", США); агарозу ("Pancreac", Испания); акриламид, бромид этидия; N, N'-метиленбисакриламид, TEMED (N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин), бромфеноловый синий, ксиленцианол, -меркаптоэтанол ("BioRad", США); персульфат аммония ("Promega", США), Tween 20, Triton X-100 ("Ferak", Германия). Остальные реактивы категории о.с.ч. получали из отечественных фирм.

Объект исследования. Для ретроспективного исследования методами AFBAC и TDT использовали образцы крови и геномной ДНК членов 104 ядерных семей, русских по этнической принадлежности (больной РС и его здоровые родители). Диагноз РС был поставлен согласно критериям Макдональда (McDonald et al., 2001); среди больных было 46 мужчин и 58 женщин, все с дебютом РС до 35 лет. У 102 больных РС было ремиттирующее течение, у двоих – первично-прогрессирующее. Средний возраст к началу заболевания – 18 ± 8 лет. Все больные и здоровые проживали в Московском регионе, оба родителя каждого больного были русскими. Образцы крови собраны в Научном центре здоровья детей РАМН и в Московском городском центре РС (ГКБ № 11). Во всех случаях получено информированное согласие больных и/или их родителей на участие в исследовании.

Полиморфные участки генов, анализ которых проводили в работе Полиморфные участки, анализ которых проводили в работе, представлены в таблице 1.

Выделение геномной ДНК из периферической крови. Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточной молекулярной массы применяли метод выделения ДНК из крови с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ (J. Sambrook, 1989).

Геномное типирование. Генотипирование полиморфного участка CCR5(wd) проводили методом анализа полиморфизма длин продуктов ПЦР. Генотипирование полиморфных участков HLA-DRB1, 874A>T IFNG, –509C>T TGFB1, –590C>T IL4, –308A>G TNF, –403G>A RANTES, 372C>T TIMP1 проводили методом ПЦР с аллелеспецифическими праймерами (ПЦР с АСП). Для генотипирования полиморфных участков 49A>G CTLA4, –174G>C IL6, –1562C>T MMP9 использовали метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продукта ПЦР (ПЦР-ПДРФ). Генотипирование локуса HLA-DRB1 проводилось М.А. Судомоиной и Е.Ю. Царевой. Использованные праймеры представлены в таблице 1. Во всех случаях ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология"). Продукты ПЦР и рестрикции анализировали методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле различной плотности в присутствии бромида этидия.

Таблица 1. Полиморфные участки анализируемых генов, методы генотипирования и использованные праймеры.

Ген

Полиморфизм*

Метод анализа

(ссылка)

Праймеры для ПЦР

[используемая рестриктаза]

HLA

-DRB1

Группы аллелей

*01-*18, соответствующие специфичностям DR1-DR18

ПЦР с АСП

из набора для амплификации HLA-DRB1 (АО «ДНК Технология», Россия)

CTLA4

SNP 49A>G

(17Thr Ala)

ПЦР-ПДРФ (Marron et al., 1997)**

5'-AAGGCTCAGCTGAACCTGGT и

5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC [BstEII]

IFNG

874A>T

ПЦР с АСП (Pravica et al., 1999)

5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3' (АСП A), 5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3' (АСП T), 5'-GTTGCTCACTGGGATTTTGG-3' (обратный)

5'-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3'

(прямой, внутренний положительный контроль)

IL6

–174G>C

ПЦР-ПДРФ (DeMichele et al., 2003)

5’-ATGCCAAGTGCTGAGTCACTA-3’ и

5’-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3’

[Nla III]

TNF

–308A>G

ПЦР с АСП

5'-ATAGGTTTTGAGGGGCATGG-3'

(АСП G),

5'-AATAGGTTTTGAGGGGCATGA-3'

(АСП A), 5’-CATGAGCTCATCTGGAGGAA–3’

(общий обратный)

5’-AGTCTCCGGGTCAGAATGAA–3’

(прямой, внутренний положительный контроль)

TGFB1

SNP –509C>T



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.