WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и при окислительном стрессе in vitro

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КОЖИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ОСОБЕННОСТИ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ ПРИ СТАРЕНИИ ЖИВОТНЫХ И ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань

2007

Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной биологии биолого-химического факультета ГОУ ВПО «Марийский государственный университет» (г. Йошкар-Ола)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Самарцев Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией регуляции

клеточного окисления Казанского института

биохимии и биофизики Казанского

научного центра РАН, г. Казань

Гордон Лев Хаймович

доктор биологических наук, ведущий

научный сотрудник Института

эволюционной физиологии и биохимии

им. И.М. Сеченова, г. Санкт-Петербург

Савина Маргарита Васильевна

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского. Московский

государственный университет

им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «27» сентября 2007 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан «___» ____________ 200__года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются не только высокоэффективными энергетическими станциями, обеспечивающими клетку АТР и теплом, но и участвуют в ее гибели по типу апоптоза и некроза. Эта альтернативная функция митохондрий связана с усилением продукции активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Hugnes еt al., 2005; Skulachev, 2006). В настоящее время известны различные пути образования активных форм кислорода в митохондриях. В дыхательной цепи в процессе одноэлектронного восстановления кислорода в I и III комплексах образуется непосредственно супероксидный анион-радикал, из которого вследствие последующих химических реакций, как ферментативных, так и неферментативных, могут образовываться пероксид водорода, гидроксильный радикал и другие активные формы кислорода (Lenaz, 1998; Brand еt al., 2004; Андреев и др., 2005). Показано, что при старении животных в митохондриях усиливается продукция активных форм кислорода (Lenaz, 1998; Barja, 2002а; Brand еt al., 2004; Judge еt al., 2005). Это, в свою очередь, приводит к мутации митохондриальной ДНК, окислительному повреждению белков и перекисному окислению липидов и, согласно одной из теорий старения, является ведущей причиной дегенеративных изменений в органах и тканях, усиливающихся с возрастом (Lenaz, 1998; Barja, 2002b; Hagen еt al., 2002; Brand еt al., 2004; Judge еt al., 2005). Предполагается, что наблюдаемые при старении окислительные повреждения митохондрий связаны со снижением активности одного из природных антиоксидантов -токоферола (Armeni еt al., 2003; Kamzalov еt al., 2004).

При моделировании окислительного стресса в митохондриях широко применяются гидроперекиси органических соединений, например, трет-бутилгидропероксид (Ltscher еt al., 1979; Costantini еt al., 1996; Slyshenkov еt al., 2002). В отсутствие ионов кальция обработка митохондрий этим оксидантом приводит к окислению пиридиновых нуклеотидов и глутатиона (Ltscher еt al., 1979; Siess еt al., 1988; Slyshenkov еt al., 2002; Liu еt al., 1996), к образованию метильного и других свободных радикалов (Kennedy еt al., 1992), к повышению уровня гидропероксидов (Martin еt al., 2000) и диеновых конъюгатов (Nigam еt al., 1999; Slyshenkov еt al., 2002).

Одним из путей подавления продукции активных форм кислорода в митохондриях является снижение разности электрохимических потенциалов протонов (µН+) на внутренней мембране при усилении протонной проводимости (Korshunov еt al., 1998; Skulachev, 1998; 2006). Показано, что это может быть достигнуто с помощью природных разобщителей окислительного фосфорилирования свободных (неэтерифицированных) жирных кислот (Korshunov еt al., 1998). В настоящее время известны различные пути разобщающего действия жирных кислот (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). В отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: АDР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров (Samartsev еt al., 1997b; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). В этом случае ингибитор АDР/АТР-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат способны подавлять разобщающее действие жирных кислот (Samartsev еt al., 1997a; Skulachev, 1998; Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова, 2005). Участие АDР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). Было предположено, что модификация АDР/АТР- антипортера продуктами перекисного окисления липидов может привести к усилению протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий в присутствии жирных кислот (Мохова и Хайлова, 2005). Интересно предположить, что при окислительном стрессе наряду с АDР/АТР-антипортером изменяются свойства и аспартат/глутаматного антипортера, и это сопровождается повышением скорости переноса аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный и (или) устранением способности лигандов этих переносчиков подавлять этот транспорт. Представляет интерес исследовать влияние антиоксидантов с различным механизмом действия на разобщающее действие жирных кислот в митохондриях старых животных в условиях эндогенного окислительного стресса, а также в митохондриях молодых животных при индукции окислительного стресса in vitro.



Целью настоящей работы является выяснение роли окислительного стресса как регулятора протонофорного разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при старении животных и действии in vitro окисляющих агентов.

Задачи исследования:

1. В опытах in vitro оценить интенсивность генерации диеновых конъюгатов и эффективность действия антиоксидантов в митохондриях печени молодых и старых крыс.

2. Выяснить, имеются ли различия в протонофорном разобщающем действии пальмитата при участии ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых крыс.

3. Исследовать влияние окислительного стресса in vitro, вызванного трет-бутилгидропероксидом, на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых крыс.

4. Изучить влияние физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров ADP и аспартата на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени молодых и старых крыс в отсутствии и присутствии антиоксидантов и окисляющего агента трет-бутилгидропероксида.

5. Выяснить, какова роль тиоловых групп митохондрий печени в модуляции протонофорной разобщающей активности жирных кислот при развитии окислительного стресса в митохондриях как молодых, так и старых крыс.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что инкубация митохондрий печени старых крыс приводит к развитию окислительного стресса и это вызывает устранение способности лигандов ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, соответственно карбоксиатрактилата и аспартата, подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот. Такие, свойственные для митохондрий старых крыс, особенности протонофорного разобщающего действия жирных кислот могут быть воспроизведены на митохондриях молодых животных путем инкубации органелл с окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что как в митохондриях старых, так и молодых животных, окислительный стресс индуцирует модификацию ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров, связанную с окислением критических SH-групп митохондрий. В присутствии физиологических субстратов этих переносчиков, соответственно ADP и аспартата, такая модификация приводит к усилению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

Положения, выносимые на защиту:

1. В митохондриях печени старых животных окислительный стресс, обусловленный пониженной активностью пассивной утечки протонов в условиях недостаточного защитного действия природных антиоксидантов, приводит к модификации ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, проявляющейся в устранении способности лигандов этих переносчиков подавлять протонофорное разобщающее действие жирных кислот.

2. В митохондриях печени молодых животных аналогичная модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров может быть воспроизведена путем инкубации органелл с окисляющим агентом трет-бутилгидропероксидом.

3. В присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров - ADP и аспартата - вызванная окислительным стрессом модификация этих переносчиков в митохондриях печени как молодых, так и старых животных, приводит к повышению протонофорной разобщающей активности пальмитата.

4. Модификация ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени молодых и старых животных связана с окислением критических SH-групп митохондрий.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при окислительном стрессе, развивающемся при старении животных и действии окисляющих агентов in vitro. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в клеточной патофизиологии и медицине, поскольку в настоящее время известно, что окислительный стресс является одним из ведущих пусковых механизмов, приводящих к гибели клеток по типу апоптоза и некроза.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международной научной конференции «Физиология развития человека» (Москва, 2004); на юбилейной конференции, посвященной 70-летию академика В.П. Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005); на 9-ой и 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005 и 2006); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2007); на V Сибирском физиологическом съезде (Новосибирск, 2005); на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); на «XIV European Bioenergetic Conference» (Moscow, 2006).





Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 28 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов исследования; полученных экспериментальных данных, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 193 библиографических названия, в том числе 167 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение митохондрий из печени крыс. В опытах использованы белые беспородные крысы-самцы в возрасте 6 – 9 месяцев с массой тела 200 – 250 г (молодые крысы) и 22 – 26 месяцев с массой тела 420 – 500 г (старые крысы). Содержание, кормление и забой животных соответствовали необходимым требованиям, изложенным в соответствующем руководстве (Западнюк и др., 1983). Митохондрии из печени животных выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования (Pedersen et al., 1978). Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ MOPS-трис (рН 7,4). Для удаления эндогенных жирных кислот митохондрии преинкубировали с очищенным от жирных кислот БСА. Суспензию митохондрий (60-70 мг митохондриального белка в 1 мл среды выделения) хранили на льду. Белок определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА.

Регистрация дыхания суспензии митохондрий. Дыхание митохондрий регистрировали при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа LP-9. Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке ~1,2 –1,3 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KСl, 5 мМ сукцинат калия, 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭГТА, 10 мМ MOPS-трис (рН 7,0 или 7,4). Олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенон добавляли в кислородную ячейку сразу после митохондрий. При определении скорости дыхания в процессе окислительного синтеза АТР (состояние 3) среда инкубации дополнительно содержала 5 мM KH2PO4 без олигомицина. В этом случае через 2 мин. после ротенона к митохондриям добавляли 200 мкМ ADP. Величину коэффициента ADP/O определяли пульсовым методом (Hinkle and Yu, 1979).

Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопрягающих агентов к величине стимуляции дыхания пальмитатом по формуле 100Ju/(Ju – Jo), где Ju и Jo - скорости дыхания соответственно в присутствии и в отсутствие пальмитата, Ju - величина снижения скорости дыхания ресопрягающим агентом.

Разобщающая активность пальмитата. Протонофорную разобщающую активность пальмитата, согласно разработанному ранее подходу (Самарцев и др., 2004) определяли как увеличение скорости дыхания пальмитатом, отнесенное к его концентрации по формуле: (Ju – Jo)/[U], где Ju и Jo – скорости дыхания митохондрий без учета их концентрации

(мкМ О2/мин) соответственно до и после добавки пальмитата, [U] – концентрация пальмитата (мкМ).

Определение диеновых конъюгатов. Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях определяли после экстракции в гептане спектрофотометрическим методом (Ambrosio et al., 1991). Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях в процессе их инкубации в контролируемом состоянии определяли следующим образом. Митохондрии (1,4 мг белка на мл) суспендировали в среде инкубации при перемешивании при 25С. Одновременно с митохондриями в среду вносили олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенона. Другие соединения, исходя их задачи исследований, добавляли одновременно с этими ингибиторами. Отбор проб (по 0,7 мм) в первый раз осуществляли сразу после этих добавок и во второй – через 5 мин. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях выражали как разницу между величинами оптической плотности гептанового экстракта при 233 нм в начальный момент времени инкубации митохондрий (А0) и через 5 мин (А) или в относительных единицах как фактор, который определяли по формуле: = (А – А0) / А0.

В работе использовали MOPS, трис, пальмитиновую кислоту, FCCP, олигомицин, сукцинат калия, глутамат калия, аспартат калия, карбоксиатрактилат, тиомочевину, n-этилмалеимид, пируват натрия, очищенный от жирных кислот БСА ("Sigma", США), ионол, тролокс (“Aldrich”, США), ротенон, ЭГТА ("Serva", Германия), ДНФ, трет-бутилгидропероксид, сахарозу (“Fluka” Германия), KCl, MgCl2 ("Merck", Германия). Остальные реактивы квалификации х.ч. и ос.ч. произведены в России. Использовали растворы пальмитиновой кислоты (20 мМ) в этаноле.

Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента с помощью пакета прикладных программ Statistica-6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Особенности разобщающего действия пальмитата и ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата в митохондриях старых крыс

Одним из индикаторов усиления генерации активных форм кислорода в клетках при различных патологических состояниях является аккумуляция продуктов перекисного окисления липидов, в том числе диеновых конъюгатов (Romaschin et al., 1990; Sokol et al., 1991; Ambrosio еt al., 1991; Drge, 2002). Как показано на рисунке 1, в митохондриях старых крыс уровень диеновых конъюгатов выше, чем в митохондриях молодых.

 Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях печени молодых и-1



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.