WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма francisella tularensis

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Павлов Виталий Михайлович

Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis

03.02.03– микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Оболенск – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, профессор  Дятлов Иван Алексеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор  Зверев  Виталий Васильевич

доктор медицинских наук, профессор  Афанасьев  Станислав Степанович

доктор медицинских наук, профессор  Дядищев  Николай Романович

Ведущая организация – Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится « 26 » _мая_ 2011 г. в « 13 » часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, пос. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии 

Автореферат разослан «  24» _февраля_ 2011 г. 
 


Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н. К. Фурсова 

Актуальность проблемы

Разработка современных лекарственных препаратов для лечения инфекционных заболеваний и средств их профилактики основывается на детальных данных о молекулярных структурах факторов патогенности и механизмах их действия. В частности, для создания вакцин важно знать, какие антигены являются протективными, а какие компоненты бактерий подавляют защитную функцию иммунной системы организма. История изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, однако до настоящего времени нет исчерпывающих сведений о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Titball R. W. et al., 2003; Домарадский И. В., 2004; Sjostedt A., 2006). Исследование генома туляремийного микроба является одним из магистральных направлений решения проблем, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов борьбы с туляремией. Проведенные недавно работы по определению нуклеотидных последовательностей геномов аттенуированного вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica LVS [http://bbrp.llnl.gov/bbrp/html/microbe. html] и природного вирулентного штамма F. tularensis subsp. tularensis Schu4 (Larsson P. et al., 2005) открыли широкие перспективы для изучения факторов патогенности и поиска протективных антигенов туляремийного микроба.

До недавнего времени адаптация общепринятых генетических методов для исследования генома F. tularensis представляла собой достаточно сложную проблему, что существенно препятствовало эффективному применению всего современного методического потенциала микробиологии для решения задач по выявлению факторов патогенности и иммуногенности туляремийного микроба.

Детальное исследование молекулярной структуры криптической плазмиды из бактерий F. novicida like F6168 (Родионова И. В. и др. 1991) позволит получить новые данные о влиянии данной плазмиды на биологические свойства бактерий рода Francisella и получить информацию, необходимую для конструирования плазмидных векторов. Важным этапом в исследованиях геномов микроорганизмов является перенос генетических структур в бактериальные клетки изучаемых микроорганизмов. Отсутствие информации о плазмидах, способных реплицироваться в F. tularensis, до последнего времени сдерживало адаптацию переноса ДНК в клетки туляремийного микроба методами трансформации. Оптимизация методов криотрансформации и конъюгации для F. tularensis позволит переносить в бактерии генетические конструкции для аллельного обмена и создавать модельные штаммы для изучения метаболизма туляремийного микроба.

Показано, что бактерии штамма F. tularensis LVS модулируют белковый синтез во время роста в макрофагах. Среди белков, индуцируемых при размножении бактерий F. tularensis внутри макрофагов, выделяется белок с молекулярной массой 23 кДа (Golovliov I. et al., 1997). Однако, функциональная роль этого белка в патогенезе F. tularensis до последнего времени выяснена не была. Одним из путей решения этой проблемы могло бы стать создание метода аллельного обмена генов в хромосоме F. tularensis, позволяющего конструировать изогенные штаммы, отличающиеся только по изучаемому гену.

Первичным защитным барьером прокариотических и эукариотических клеток являются белки семейства суперокиддисмутаз (СОД), которые превращают токсичный радикал O2– в молекулярный кислород (O2) и перекись водорода (H2O2) (Miller R. A. et al., 1997). У туляремийного микроба также выявлена СОД (Шимоняк Н. И. и др., 1992), тем не менее, роль этого фермента в патогенезе туляремии и в бактериальном метаболизме до последнего времени не была выяснена. Попытки инактивации СОД в других патогенных микроорганизмах приводили к потере жизнеспособности бактерий. Поскольку метод аллельного обмена позволяет не только инактивировать гены, но и модулировать их синтез, этот подход может быть использован для изучения СОД туляремийного микроба.



Живая туляремийная вакцина на основе штамма F. tularensis 15/10 была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (Олсуфьев Н. Г., 1975). На основе этого же штамма в США был получен штамм F. tularensis LVS и создана экспериментальная живая вакцина (Eigelsbach H. T. et al, 1961).

Поскольку обе вакцины обладают определенной реактогенностью, обусловленной не охарактеризованными пока факторами патогенности (Олсуфьев Н. Г., 1975), то проводимый в настоящее время сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов вакцинного штамма LVS и природных штаммов, несомненно, облегчит задачу создания генетически охарактеризованного современного вакцинного штамма без остаточных факторов реактогенности. Очевидно, что без эффективных методов целенаправленного аллельного замещения невозможно достижение существенных успехов в понимании молекулярных основ действия факторов как реактогенности, так и иммуногенности туляремийного микроба.

В качестве бактериальных векторов для получения рекомбинантных вакцин используют целый ряд микроорганизмов, среди которых: аттенуированные штаммы M. tuberculosis (Ellner J.J., 1998; Senaratne R.H, et al., 2007; Henao-Tamayo M. et al., 2007), близкородственные микобактерии (Abou-Zeid C. et al., 1997),а также сальмонеллы (Mollenkopf H.J. et al., 2001) и некоторые другие (Miki K. et al., 2004). Известно, что туляремийная вакцина, обладая умеренной реактогенностью, вызывает формирование длительного напряженного иммунитета (Tarnvik A.,1989). Кроме специфического иммунитета вакцинные штаммы F. tularensis индуцируют краткосрочную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов (Legionella, Listeria и др.) (Belyi Y. F. et al., 1996). До последнего времени изучение иммуномодулирующих свойств штамма F. tularensis 15/10 сдерживалось из-за отсутствия генетических методов по переносу дополнительных генов, кодирующих протективные антигены, в клетки вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма туляремийного микроба с гетерологичными протективными антигенами (в частности, наиболее иммуногенными антигенами M. tuberculosis Ag85В и ESAT-6) позволит оценить потенциал вакцинного туляремийного штамма в качестве нового бактериального вектора.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность разработки молекулярных инструментов для всестороннего исследования туляремийного микроба. Полученные модифицированные штаммы туляремийного микроба смогут открыть новые перспективы для изучения иммунобиологических свойств туляремийного микроба и получить детальную информацию о факторах патогенности и иммуногенности F. tularensis.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка методологии молекулярно-генетического изучения F. tularensis и оценка с ее помощью роли отдельных генетических структур в иммунопатогенезе туляремийной инфекции.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Адаптировать и оптимизировать условия переноса плазмидных ДНК в клетки F. tularensis методами трансформации, конъюгации и мобилизации.
  2. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность криптической плазмиды из бактерий F. novicida like F6168, а также исследовать функциональную активность выявленных плазмидных генов.
  3. Создать ряд плазмидных векторов для клонирования промоторов и экспрессии гетерологичных генов протективных антигенов в F. tularensis и изучить их свойства.
  4. Создать варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза, и изучить иммунобиологические свойства полученных штаммов.
  5. Разработать систему аллельного замещения генов в хромосоме туляремийного микроба и способ получения вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами iglC и sodB.
  6. Изучить иммунобиологические свойства полученных вариантов F. tularensis 15/10 и штамма LVS, дефектных по генам iglC и sodB.

Новизна исследования

Впервые разработана система для аллельного замещения генов в хромосоме F. tularensis. Созданы плазмидные векторы для конструирования плазмид, необходимых для осуществления аллельного обмена в хромосоме F. tularensis. Предложенный метод позволяет: а) удалять определенные участки генома F. tularensis, б) модифицировать регуляторные и другие области оперонов; в) получать генетически маркированные вакцинные штаммы F. tularensis.

Впервые в геноме F. tularensis выявлены две копии гена iglC, кодирующего белок с молекулярной массой 23 кДа, и показана необходимость продукта гена iglC для внутримакрофагального размножения вакцинного штамма F. tularensis. Вариант вакцинного штамма без генов iglC не защищал вакцинированных мышей от гибели при заражении штаммом F. tularensis 503.

Показано снижение экспрессии гена sodB в F. tularensis в результате замены последовательности нуклеотидов инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB. Вакцинный штамм со сниженным уровнем синтеза белка СОД B обладает меньшей вирулентностью для мышей, чем немодифицированный вакцинный штамм.

Впервые показана возможность введения плазмид в вакцинный штамм туляремийного микроба методом криотрансформации. Оптимизированы условия криотрансформации F. tularensis.





Впервые показана возможность мобилизации плазмид из клеток Escherichia coli в клетки F. tularensis и оптимизированы условия межвидового скрещивания. Созданы мобилизуемые плазмидные векторы, позволяющие переносить фрагменты ДНК из E. coli в F. tularensis.

Впервые получен вариант конъюгативной плазмиды pSa, способный с высокой эффективностью переноситься из E. coli в F. tularensis и, наоборот, из F. tularensis в E. coli.

Проведено структурно-функциональное исследование криптической плазмиды из рода Francisella – плазмиды pFNL10. Выявлена способность плазмиды pFNL10 стабильно реплицироваться в клетках вакцинного штамма туляремийного микроба. Показано, что вклад в стабильность наследования плазмиды рFNL10 бактериями F. tularensis вносят продукты плазмидных генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы фага Р 1.

Впервые созданы стабильные плазмидные векторы для вакцинного штамма F. tularensis, позволившие приступить к изучению возможности использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании современных рекомбинантных вакцинных штаммов.

Впервые на основе F. tularensis 15/10 созданы штаммы, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза. Показан повышенный синтез клетками F. tularensis гибридных белков, состоящих из лидерной части предшественника основного белка внешней мембраны F. tularensis Fop A и белкового антигена M. tuberculosis.

Впервые показано формирование специфического иммунного ответа на туберкулезные антигены у мышей, вакцинированных штаммами F. tularensis, синтезирующими протективные антигены возбудителя туберкулеза. Вакцинированные мыши обладали повышенной устойчивостью к аэрозольному заражению возбудителем туберкулеза.

Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

Практическая значимость

Разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих мутантов F. tularensis, сочетающая локализованный мутагенез in vitro и гомологичную рекомбинацию in vivo, а также позволяющая получать достоверные данные о роли выбранных генов в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя туляремии.

Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках F. tularensis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную продукцию туберкулезных антигенов в клетках вакцинного штамма F. tularensis.

Сконструированы штаммы F. tularensis RVp17 и RVp18, способные к синтезу основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза, которые могут служить основой для разработки новой рекомбинантной живой туберкулезной вакцины.

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) депонированы 11 авторских штаммов, необходимые для изучения генетических детерминант факторов иммуногенности и патогенности возбудителя туляремии, а также сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» (Федеральный уровень внедрения, 2007 г.), Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2003 г.) и Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2009 г.)

Положения, выносимые на защиту:



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.