WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Особенности очага висцерального лейшманиоза в папском районе наманганской области узбекистана

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Жиренкина Екатерина Николаевна

Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана

03.02.11 – паразитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Понировский Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

Черникова Евгения Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры тропической медицины и паразитарных болезней медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Довгалёв Анатолий Семёнович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой тропических и паразитарных болезней факультета профилактической медицины и организации здравоохранения ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_____» июня 2013 года в ______ часов

на заседании диссертационного совета Д 208.040.12 при Первом МГМУ

имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан «_____» _________________ 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Висцеральный лейшманиоз (ВЛ) среди других лейшманиозов Старого Света является наиболее опасным заболеванием: при отсутствии вовремя поставленного диагноза и специфического лечения, как правило, развитие болезни приводит к смерти пациента. ВЛ, вызываемый Leishmania infantum (синонимы: средиземноморский лейшманиоз, детский лейшманиоз), в Старом Свете распространен, главным образом, в странах Средиземноморья, Ближнего и Среднего Востока, Закавказья и Центральной Азии. Несмотря на то, что лейшманиозы зарегистрированы в 98 странах, только из 33 стран поступают сообщения о местных случаях заболевания, что связано с отсутствием обязательной регистрации больных лейшманиозами в большинстве стран.

В первой половине прошлого века Узбекистан занимал лидирующее положение по числу заболевших висцеральным лейшманиозом среди республик СССР. Однако к концу 60-х годов ХХ столетия в результате проведенных мероприятий заболеваемость снизилась до спорадических, единичных случаев (Исаев Л.М. и соавт., 1966). В настоящее время основной очаг ВЛ находится в Папском районе Наманганской области Узбекистана (Maroli M. et al., 2001). Всего с 1987 по 2009 гг. зарегистрировано 95 случаев ВЛ в 9 населенных пунктах этого района (Коваленко Д.А. и соавт., 2011). Возобновление заболеваемости ВЛ в Республике Узбекистан показало необходимость изучения современного распространения случаев ВЛ среди людей, выявления резервуара инфекции и переносчиков с использованием актуальных методов исследования.

Цель диссертационной работы: изучить особенности очага ВЛ в Папском районе Наманганской области Узбекистана с применением классических паразитологических и современных молекулярно-биологических методов. Задачи исследований:

  1. Обследовать детей до 15 лет в 5 населенных пунктах Папского района

Наманганской области Узбекистана, где случаи ВЛ регулярно регистрируются в последние годы.

  1. Обработать клинические образцы, полученные при обследовании людей, методом ПЦР, предварительно адаптировав его для выявления 1 паразита в 0,1 мл образца материала.
  2. Изучить видовой состав и выявить эпидемически опасные виды москитов.
  3. Определить факторы, способствующие функционированию паразитарной системы ВЛ в данной местности.

Научная новизна результатов исследований

Впервые на территории Содружества Независимых Государств (СНГ) обследован очаг ВЛ с применением современного метода молекулярной диагностики, позволившего получить прежде неизвестные факты об эпидемиологии заболевания.

Выявлен значительный процент ПЦР-положительных реакций у практически здоровых детей, свидетельствующий о бессимптомном носительстве и опровергающий прежнее представление о ВЛ у детей как только об острой инфекции с быстро развивающимися клиническими симптомами. Этот факт позволяет считать ВЛ оппортунистической инфекцией.

ДНК лейшманий была обнаружена в крови обследованных детей, что позволяет использовать образцы периферической крови при скрининговых обследованиях населения эндемичных по ВЛ территорий, предполагает пересмотр роли человека как источника инфекции при ВЛ, заставляет ужесточить правила безопасности инъекций и сопутствующих процедур.



Практическая значимость результатов исследования

Результаты исследований используют при проведении мероприятий по эпидемиологическому надзору в Узбекистане.

Материалы исследований включены в циклы лекций кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава РФ, а также используются в практике проведения учебных курсов по паразитарным болезням на базе НИИ медицинской паразитологии им. Л.М.Исаева Министерства здравоохранения Республики Узбекистан и клиники института.

Внедрение материалов исследований в практику

Материалы исследований включены в справочное пособие «Методики клинических лабораторных исследований». Т. 3. Под ред. В.В. Меньшикова, 2009.

Положения, выносимые на защиту

1. В населенных пунктах Папского района Наманганской области Узбекистана висцеральным лейшманиозом болеют дети, в основном до 3-х лет, что делает эти очаги сходными с другими очагами Средиземноморского ВЛ. Отличительной чертой является значительный процент детей, в крови которых обнаружена ДНК возбудителя ВЛ, без клинических проявлений - бессимптомных носителей инфекции, исследованных специально адаптированным (для обнаружения до 1 паразита в 0,1 мл клинического образца) методом ПЦР.

2. Очаги ВЛ в Папском районе Наманганской области в настоящее время являются синантропными, возбудитель циркулирует внутри населенных пунктов, основными источниками инфекции являются поселковые собаки, переносчиком – Phlebotomus longiductus.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации были доложены: на коллоквиуме отдела молекулярной паразитологии Института микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите, г. Берлин, май 2008 г., на коллоквиумах ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, февраль 2010 г., июнь 2012 г.,- на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика - 2010», г. Москва, 24-26 ноября 2010 г., на специализированной комиссии НИИ МПТМ им. Е.И.Марциновского и кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ 1 МГМУ им. И.М.Сеченова 19 марта 2013 года.

Личный вклад автора

Лично автором оптимизирован режим амплификации, проведено исследование 234 клинических и 380 биологических образцов методом ПЦР на наличие ДНК возбудителя висцерального лейшманиоза, приготовлены постоянные препараты и проведено видовое определение москитов. Выполнен анализ полученных данных, описание района исследований, определение природных и социальных факторов в становлении и функционировании очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана, обобщение материалов и литературных данных, а также статистическая обработка результатов.

Публикации

По материалам исследований опубликовано 5 работ в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 163 источника, из которых 82 на русском языке. Работа проиллюстрирована 11 таблицами и 14 рисунками.

Благодарности

Работа выполнена в рамках проекта INTAS (№ 05-1000008-8043) «Борьба с висцеральным лейшманиозом в Узбекистане путем создания системы эпиднадзора с использованием новейших иммунологических и молекулярно-биологических методов».

Выражаю глубокую признательность всем участникам проекта INTAS за плодотворную, совместную работу, а также медицинскому персоналу Папского района Узбекистана, предоставившему образцы для наших исследований. Выражаю признательность руководителю проекта - доктору Габриеле Шониан за предоставленную возможность стажировки в Институте микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите (Берлин, Германия) и работы по определению зараженности москитов молекулярным методом. Особую благодарность выражаю Стрелковой Маргарите Витальевне за постоянное внимание к моей работе на всех ее этапах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объем исследований. Сбор материала проводили во время экспедиционных выездов в июле и ноябре 2007, в марте и сентябре 2008 гг. В качестве обследуемого контингента были выбраны дети до 15 лет в пяти населенных пунктах Папского района Наманганской области: Чодак, Олтинкан, Гулистан, Чоркесар, Хонобад. Дополнительно в обследование были включены пациенты двух больниц. Всего исследовано 234 образца: 3 – пунктата костного мозга, 9 - венозной крови и 222 - крови из пальца. Все образцы на предметных стеклах (объем материала 0,1 мл).

Энтомологические наблюдения проводили в 4-х из 5-ти обследованных населенных пунктов. Всего отловлено 7671 москит. На наличие ДНК L. infantum в москитах исследовано 380 самок 5 видов: P. angustus, P. keshishiani, P. longiductus, P. papatasi, P. sergenti.

Методы исследований. С клиническими образцами проводили амплификацию области ITS1. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора DNA Purification Kit (Promega, USA). Для составления реакционной смеси пользовались наборами PCR-core («Изоген», Россия). Использовали праймеры: LITSR (CTG GAT CAT TTT CCG ATG) и L5.8S (TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT), синтезированные фирмой «Syntol», Россия. Амплификацию проводили на программируемом термоциклере Терцик-М («ДНК-технология», Россия). Режим амплификации: 940С – 5 мин; (920С – 20 сек; 500С – 30 сек; 650С – 90 сек) 45 циклов. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле.





Обработка клинического материала проходила в два этапа: на первом все образцы исследовали с помощью родоспецифичных праймеров LITSR-L5.8S с целью обнаружения ДНК лейшманий. На втором этапе исследовали только положительные образцы, используя секвенирование для видовой идентификации. Секвенирование амплифицированного фрагмента позволило выравнять по БЛАСТ (BLAST - Basic Local Alignment Search Tool) фрагменты длиной 320 п.н. как L. infantum.

Мазки костного мозга человека также исследовали методом световой микроскопии в соответствии со стандартной методикой (МУК 4.2.735-99.).

Москитов отлавливали в жилых и хозяйственных помещениях на «липучки», а также световыми ловушками и эксгаустером. Листы полупергамента (20x30 см), смазанные касторовым маслом («липучки») развешивали в помещениях вечером по методике Н. М. Расницыной (1973), снимали утром. Из отловленных москитов готовили препараты по общепринятой методике (Петрищева П. А., 1961) и определяли, используя морфологические признаки и определительные таблицы (Артемьев М. М., Неронов В. М., 1984).

Для определения зараженности самок москитов лейшманиями проводили амплификацию с праймерами LITSR/L5.8S, предварительно выделив суммарную ДНК фенол-хлороформным методом, результаты визуализировали в УФ-трансиллюминаторе.

Статистическая обработка результатов. Для определения достоверности различий качественных признаков использовали таблицы сопряженностей с вычислением значения критерия. Расчеты проводили с помощью статистического пакета Statgraphics 5.0.

ОПИСАНИЕ РАЙОНА ИССЛЕДОВАНИЙ

Узбекистан – государство в Центральной Азии, граничит с Киргизстаном на северо-востоке и востоке, с Казахстаном на севере и северо-западе, с Таджикистаном на юго-востоке, с Туркменистаном на юго-западе, и на юге – с Афганистаном. Материал для наших исследований был собран в Папском районе Наманганской области Узбекистана, расположенном на востоке страны.

Поселок (кишлак) Чоркесар (410224с.ш., 7005436в.д.) находится на юго-восточном склоне Кураминского хребта на границе скалистых гор и холмистых предгорий. Население поселка распределено вдоль сезонной реки Ингичка-сай, стекающей с гор в южном направлении. Вдоль горной реки Чодаксай (Кудаксай) расположены поселки Хонобад (4005400с.ш., 7004724в.д.), Чодак (4005700с.ш., 7004536в.д.), Олтинкан (4005600 с.ш., 7004500в.д.) и Гулистан (410300с.ш., 7004236в.д.). Расстояние между поселками 3-6 км, Хонобад-Чоркесар – 20 км.

Климат - резко континентальный, годовое количество осадков – 350-450 мм, при этом с мая по сентябрь выпадает 5-12,2% от их годового количества. Дефицит воды для орошения и небольшое количество выпадающих атмосферных осадков, недостаток плодородных почв делают невозможным посев зерновых культур и развитие садоводства и огородничества на больших площадях. Население живёт за счёт выращивания садово-огородной продукции на своих приусадебных участках (площадью 50-1500 м2), отгонного скотоводства и ремесленного дела.

С удалением от населенных пунктов, а, следовательно, и водного источника, растительность становиться более скудной, состоящей в основном из эфемеров полупустынного типа. В окрестностях населенных пунктов нередки волк (Canis lupus), лисица (Vulpes vulpes), барсук (Meles meles), дикобраз (Hystrix hirsutirostris).

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК L. infantum В МАЗКАХ КРОВИ

На начальной стадии работы были проведены специальные опыты с целью оптимизации режима амплификации для обнаружения минимального числа паразитов в препарате. Из 7-10 дневной культуры штаммов L. infantum (MHOM/KZ/75/MarzDzha) и L. donovani (MHOM/IN/80/DD8) готовили препараты на предметных стеклах, смешивая паразитов и кровь людей, никогда не выезжавших в очаг ВЛ. Мы использовали разведение 100, 10 и 1 промастигота на 0,1 мл крови. Препараты крови на предметном стекле высушивали при комнатной температуре. Оценивали: количество вносимой ДНК, разную температуру отжига праймеров, число циклов амплификации.

В результате тестирования 80 образцов был выбран режим, позволяющий обнаруживать ДНК одной клетки паразита в препарате.

ОСОБЕННОСТИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ВИСЦЕРАЛЬНОГО ЛЕЙШМАНИОЗА В ПАПСКОМ РАЙОНЕ НАМАНГАНСКОЙ ОБЛАСТИ УЗБЕКИСТАНА

Распространение случаев висцерального лейшманиоза в населенных пунктах Папского района. Первые случаи заболевания ВЛ в Папском районе были зарегистрированы еще в 1987 г. (Фузайлов Ю.М., 1989), ранее в этих населенных пунктах случаи заболевания никогда не регистрировались. Однако если в период с 1987 по 2000 гг. число случаев колебалось от минимальных значений - 0 до максимальных - 5 случаев заболевания в год (всего за этот период зарегистрировано 20 случаев), то с 2001 г. наблюдается ежегодный рост случаев заболевания (всего 75 случаев ВЛ). Кроме того, за последние 9 лет более чем в два раза выросло и количество населенных пунктов, где был зарегистрирован ВЛ. Распределение случаев ВЛ по населенным пунктам представлено в таблице 1.

Таблица 1. - Распределение больных висцеральным лейшманиозом

по населенным пунктам в Папском районе Наманганской области в 1987-2009 гг.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.