WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Науки государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии фгун гнц пмб игнатов сергей георгиевич разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов

-- [ Страница 2 ] --

Публикации

По теме диссертации опубликовано 58 печатные работы, 23 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, издана одна монография, получен один патент.

Место выполнения работы

Работа проводилась в ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) в рамках НИР и международных проектов.

Основные защищаемые положения

1. Электрооптический метод анализа бактерий позволяет контролировать физиологическое состояние бактерий и их выживаемость в ходе биотехнологических процессов.

2. Новые биосенсоры на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов увеличивают чувствительность и скорость определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий в анализируемой системе.

3. Использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ) совместно с получением аффинных поверхностей повышает чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

4. Применение АСМ позволяет более нативно анализировать аффинные взаимодействия в микробиологии.

5. Токсичность наноматериалов может оцениваться с помощью микробиологических приемов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В работе использовали бактерии Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Acetobacter aceti, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Streptomyces avermitilis и аскомицет Neurospora crassa. Для индукции специфических ферментативных активностей микроорганизмы культивировали на минимальных средах с различными источниками углерода. Мицелий аскомицета выращивали на модифицированной среде Фогеля, содержащей минеральные соли, сахарозу и биотин.

Выделение мембран проводили путем осмотического лизиса сферопластов (Игнатов и др. 1981), полученных после обработки клеток лизоцимом с последующей промывкой центрифугированием при охлаждении. Путем субстратной индукции получали цитоплазматические мембраны (ЦПМ) с заранее заданными ферментативными свойствами. Наличие нативной иммобилизации ферментативных ансамблей в липидном бислое обеспечивает более стабильную и чувствительную систему анализа. Поверхностный заряд ЦПМ изменяли, используя положительно заряженные цетилтриаммоний бромид и полилизин и отрицательно заряженные додецилсульфат натрия и полиаспарагиновую кислоту.

Для проведения криоиммобилизации клетки и мембраны смешивали с заранее приготовленным 10 %-ным раствором поливинилового спирта. Суспензию раскапывали по пластиковой поверхности и помещали в холодильник для формирования криогеля. После 24 ч экспозиции при низкой температуре гранулы иммобилизованных клеток и мембран оттаивали, промывали несколько раз фосфатным буфером (рН 7,4) и хранили в нем. Приготовленные заранее навески иммобилизованных биокатализаторов использовали для детекции соответствующих активностей.

Для размножения и титрования фагов использовали полужидкий L-агар с 0,4 %-ной глюкозой. Для экспериментов использовали заранее размноженные фаги в концентрации – 1010–1011 частиц/мл.

Исследования антиоксидантной активности соединений проводили в электрохимической ячейке, имеющей трехэлектродную конфигурацию. Ячейка объемом 1мл включала Ag/AgCl/ 1M KCl электрод сравнения и Pt обратный (рабочий) электрод. Циклическую вольтаметрию осуществляли с использованием системы "Автолаб". Для измерения антиоксидантной активности модифицированный золотой электрод поляризовали при +150мВ по отношению к Ag/AgCl. В качестве потенциостата использовали «Биоанализатор» фирмы Kreijci Engineering (Чехия).

При определении лактата для приготовления чувствительной к кислороду волоконно-оптической системы готовили тонкую силановую пленку с чувствительным к кислороду флуоресцентным красителем, рутений дифенилфенантролином, которую механически крепили на конце оптического волокна. Пленку готовили путем приготовления фотополимеризующего раствора, содержащего мономер силоксана, раствора красителя и индуктора на поверхности чашки. При помощи УФ лампы индуцировали полимеризацию раствора и механическое включение красителя в полимер. Полимерную пленку помещали в раствор дистиллированной воды и хранили в темноте перед использованием. На поверхность этого чувствительного к кислороду слоя помещали препарат ЦПМ, адсорбированный на целлюлозном диске. Всю конструкцию крепили на оптическое волокно нейлоновой сеточкой с помощью резинового кольца.

АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope IIIa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06, 0,32, 0,58 и 0,12 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Мышиные перитонеальные макрофаги получали путем инъекции стерильного раствора NaCl (0,9 %) в перитонеальную область мышей. После абдоминального массажа собирали перитонеальную жидкость, которую помещали на покровное стекло в присутствии среды 199 с 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой в стерильной чашке Петри с нанообразцами. Затем добавляли 100 мкл бактериальной суспензии (106 клеток/мл) и культивировали 2 час при 37 °С. После инкубации монослой макрофагальных клеток на покровном стекле фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому. Изменения бактерицидной активности макрофагов изучали с помощью светового микроскопа Olympus BX41.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1 Электрооптические методы исследования

На примере клеток E. coli и B. thuringiensis показана эффективная возможность оценки жизнеспособности бактерий на основных этапах биотехнологического производства биопрепаратов - этапах ферментации, концентрирования и сушки. На получение и обработку электрооптических данных уходит не более 20 мин. При определении интактных клеток учитывался тот факт, что в интервале 7,5 lgfo 7,8 (где fo частота задаваемого поля) электрооптический сигнал практически равен нулю. Оценку инактивирующего воздействия оценивали (в %) путем сравнения величины электрооптического эффекта (ЭОЭ) до и после воздействия в выбранном нами интервале частоты электрического поля. Электрооптические результаты сравнивали с результатами, полученными путем высева бактериальных клеток на твердые питательные среды, с последующим подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ). Как видно из табл. 1, электрооптический метод позволяет аккуратно и быстро оценить жизнеспособность микроорганизмов после определенного экстремального воздействия.

Таблица 1 - Изменение ЭОЭ и жизнеспособности клеток E.coli и B. thuringiensis на этапах ферментации, концентрирование и сушки

Биотехнологический этап E. coli B. thuringiensis
Выживаемость клеток, % ЭОЭ, % Выживаемость клеток, % ЭОЭ, %
Инокулят 100 100 100 100
Ферментация 80±8 78±8 82±8 80±8
Концентрирование 67±8 65±8 78±8 77±8
Сушка 13±7 9±7 40±7 39±7


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.