WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

Науки государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии фгун гнц пмб игнатов сергей георгиевич разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов

-- [ Страница 4 ] --

1 мин

Рисунок 10 - Схема отклика сенсорного электрода на образование супероксида при добавлении антиокисиданта и супероксиддисмутазы. 1 – добавление 100 мM гипоксантина; 2 – добавление ксантиноксидазы, 50 мЕ/мл; 3,4,5 – добавление антиокисиданта; 6 – добавление супероксиддисмутазы, 2 Е/мл. А, А’ и А’’- понижение сигнала при различной концентрации антиокисиданта в среде

Как известно, антиоксиданты предохраняют организмы от вредного воздействия активных форм кислорода. Поэтому использование биосенсорного подхода для регистрации антиокидантных свойств веществ нашло важное применение в медицине и пищевой промышленности. Для определения антиоксидантной активности различных веществ показана высокая эффективность использования супероксидно-специфического амперометрического биосенсора (рис. 10).

Антиоксидантная активность субстратов представлена в табл. 2.

Таблица 2 - Антиоксидантная активность субстратов, где I50 As.ac – концентрация аскорбиновой кислоты, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, I 50 – концентрация субстрата, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, E asc,ac – Единицы аскорбиновой кислоты (I 50 As.ac/ I 50)

Вещество Сигнал электрода, нА I 50 As.ac, мкМ I 50, нМ E asc,ac
(-) Эпигаллокатехин 0,8 9,0 83,7 107,5
(+) Катехин 0,4 9,6 600,0 16,0
(+/-) Катехин 0,8 9,0 277,0 32,4
Пирогаллол 0,8 9,0 262,7 34,3
Мирицетин 0,6 7,7 454,7 17,0
Кверцетин 0,7 4,8 2400,0 2,0
Танниновые кислоты 0,8 6,6 473,0 14,0

Исследование данных веществ показало их высокую антиоксидантную активность. Установлено, что обработка бактериальных клеток данными антиоксидантами частично предотвращает их элиминацию в мышиных макрофагах.

Глава 3 Бионанотехнологические подходы исследования в микробиологии

3.1 АСМ микроскопия вирусов

Вирусы были выбраны для исследования как наименьшие живые биологические структуры. Существует два метода иммобилизации вирусов: специфическая и неспецифическая. Неспецифический метод заключается в нанесении капли вирусной суспензии на поверхность. Специфический метод основан на предварительной модификации поверхности специфическими антителами. Стандартные методы получения монослоев вирусных антител базируются на ковалентном связывании антител с поверхностью. Хорошо известно, что монослои антител и ферментов могут терять свою активность. Чтобы этого не происходило, используют амфифильные полиэлектролиты и липиды. Был разработан метод с использованием лэнгмюровских пленок антител на амфифильном полиэлектролите для иммобилизации ротавирусов и аденовирусов с последующей визуализацией методом АСМ. Аденовирусы и ротавирусы – важные патогены человека. На рис. 11 представлены АСМ изображения аденовирусов и ротавирусов, полученные с помощью неспецифической иммобилизации.

А Б

 АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на-9 АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на-10

Рисунок 11 - АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на поверхности. Справа показан вертикальный профиль поверхности





Такие образцы очень нестабильны и быстро разрушаются при хранении. Чтобы повысить специфичность и стабильность иммобилизованных вирусов, использовали антитела для их специфического связывания с поверхностью. Для этого применяли лэнгмюровские пленки антител на амфифильных электролитах – полиэтиленимине и полибензилгистидине. Применение таких электролитов делает возможным предохранение конформации белковой глобулы от действия инактивирующих факторов на границе раздела фаз воздух/вода и приводит к усилению взаимодействий между компонентами лэнгмюровских пленок. Были протестированы различные условия образования монослоев полиэлектролитов. В качестве критерия использовали степень шероховатости получаемых пленок. В случае полибензилгистидина стало возможным получать пленки толщиной 1,5-2 нм и шероховатостью 0,2 нм, что в результате приводит к увеличению аффинности пленок полимер/антитело.

После месяца хранения при +5 °С пленки антител оставались целыми, сохраняя свою иммунную активность. Для определения толщины полученной пленки антител специально разрушали небольшую область ее поверхности. Разница в высоте разрушенного и целого слоев интерпретировалась как толщина пленки, которая составляла 8-12 нм в зависимости от выбранной области и материала субстрата (рис. 12).

 Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки. Слева (А)-11

Рисунок 12 - Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки. Слева (А) показан участок пленки, специально разрушенный для оценки толщины пленки. Справа (В) показана нативная пленка

Используя этот подход, можно получать специфически иммобилизованные аденовирусы и ротавирусы. На рис. 13 представлены АСМ изображения ротавирусов и трехмерное изображение аденовирусов.

А Б

 АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение-12 АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение-13

Рисунок 13 - АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение аденовирусов (Б), специфически связанных с пленкой соответствующих антител, образованной на амфифильном полимере

3.2 АСМ микроскопия бактерий

Существует множество методов исследования бактерий. Качественную и количественную характеристики бактериальных клеток можно получить методами световой и электронной микроскопии, фотоэлектронной микроскопии Х-лучей, ИК-спектроскопии, измерениями контактного угла и электрофоретической мобильности. Однако многие из этих методов требуют специальной подготовки и условий вакуума во время анализа и не могут быть использованы для нативных исследований. В последние годы в микробиологии открыт новый способ исследования бактерий. АСМ микроскопия обеспечивает получение 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях. Поверхность живых бактериальных клеток - это очень сложная гетерогенная структура, содержащая липидные, белковые и углеводные компоненты. Организация некоторых мембранных областей играет важную роль во взаимодействии клеток с поверхностью и между собой. Вместе с тем, несмотря на то, что ультраструктура микробной поверхности изучается методом электронной микроскопии уже более 30 лет, прямой информации о ее строении в нативном состоянии получить таким способом нельзя. Понимание процессов адгезии и агрегации бактериальных клеток требует не только знания физико-химических свойств (гидрофобности и электрических свойств) и химического состава, но также наномеханических свойств и ультраструктуры их поверхности. Уникальная возможность АСМ представлять бактериальный мир в субнанометровом диапазоне и в водном растворе может быть использована для исследования как самих клеток, так и их поверхности в физиологических условиях. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. В водных средах микроорганизмы имеют тенденцию образовывать колонии на твердых поверхностях, создавая биопленки. Это вызывает загрязнение трубопроводов, морских сооружений и кораблей. Протекающие при этом коррозиционные процессы также изучаются методами АСМ.

В данной работе мы использовали АСМ для идентификации патогенных бактериальных клеток. Некоторые АСМ изображения получены с использованием неспецифической адсорбции бактерий (рис. 14).

 АСМ изображение клеток M. tuberculosis Для специфической-14  АСМ изображение клеток M. tuberculosis Для специфической-15

Рисунок 14 - АСМ изображение клеток M. tuberculosis

Для специфической визуализации бактерий был разработан новый подход, основанный на иммобилизации специфических антител непосредственно на твердой подложке через связывание антител стафилококковым белком А. Белок А специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител. Получены изображение слоя белка А (рис. 15) и 3D изображения специфически иммобилизованных бактерий и спор (рис. 16) с использованием слоя белка А для чувствительной иммобилизации специфических антител.

 Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А -16

 Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А АСМ-17

Рисунок 15 - Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А

АСМ очень важна при быстрой и суперчувствительной детекции патогенов. Уникальные возможности АСМ можно использовать в дальнейших исследованиях в нанобиотехнологии не только для детекции бактериальных клеток и вирусов, но и для очень чувствительного определения нанофрагментов этих объектов.

 Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и-18

 Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и-19

 Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и-20

 Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и спор-21

Рисунок 16 - Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и спор (справа) B. thuringiensis с использованием слоя белка А

3.3 Изучения взаимодействия фаг-бактерия

Был разработан протокол приготовления образцов для визуализации с помощью АСМ взаимодействия бактерий с бактериофагами. Для этого растворы, содержащие живые бактерии E. coli и бактериофаги, специфичные к данному штамму, смешивали и помещали в термостат при 37 °С. Через определенные промежутки времени из термостатируемого раствора извлекали 5-10 мкл смеси для нанесения на слюду и АСМ-мониторинга. Полученные результаты показали эффективность использования АСМ для такого рода систем. На рис. 17 и 18 хорошо видна динамика взаимодействия фаг-бактерия.

А Б

 АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин-22 АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин-23

Рисунок 17 - АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин после добавления фагов (Б)

А Б

 АСМ изображение клетки E. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б)-24 АСМ изображение клетки E. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б)-25

Рисунок 18 - АСМ изображение клетки E. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б) инкубации с фагом

На рис. 17А приведено изображение единичной бактериальной клетки при отсутствии бактериофагов. Через 15 мин после добавления бактериофагов (рис. 17Б) изображение бактериальной клетки изменяется и можно видеть фаговую "шубу" на поверхности бактерии. После 35 мин инкубации бактерий с фагами (рис. 18А) наблюдается выход большого количества фагов из бактериальной клетки в результате ее лизирования. На рис. 18Б изображена бактериальная клетка после фагового лизиса (видны морфологические изменения бактерии и следы выхода бактериофагов). Данная картина является типичной после инкубирования бактерий с бактериофагом более 1 ч.

Кроме этого, были проведены исследования наноструктуры аффинных поверхностей, представляющих собой антитела, закрепленные на латексных и магнитных частицах. Получены изображения высокого разрешения, позволяющие произвести визуальную оценку процесса агглютинации латексных частиц, несущих специфичные антитела, с антигеном и изображения бионанообъектов, отражающие динамику взаимодействия фагов с бактериальной клеткой – мишенью.

3.4 Изучение фрагментов бактериальных клеток

Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аффинной поверхностью нами была предложена следующая структура этой поверхности: активированная слюда – белок G – антитело. Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка G, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специфического взаимодействия). Толщина слоя белка G возрастает с увеличением его концентрации в растворе, причем оптимальная величина находится в диапазоне 0,1-0,6 мг/мл, при которой толщина слоя составляет до 1,3 нм (рис. 19).

Поверхности, модифицированные «родными» антителами (к E. coli), а также «чужими» антителами (к Salmonella), были изучены как поверхности для связывания с фрагментами клеток E. coli. Из АСМ-изображений, представленных на рис. 20, следует, что количество нанофрагментов, адсорбированных «родными» антителами, в сотни раз больше, чем «чужими». При приготовлении образцов, представленных на рис. 20, время экспозиции поверхности с нанофрагментами составляло 3 мин, а объем раствора с антигеном – 5 мкл. При таких параметрах адсорбции поверхность переставала эффективно адсорбировать антиген с концентрациями 107 клеток/мл и ниже. В связи с этим, параметры адсорбции подбирались таким образом, чтобы позволять детектировать малые концентрации.

 АСМ изображения модифицированных антителами к-31



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.