WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |

Науки государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии фгун гнц пмб игнатов сергей георгиевич разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов

-- [ Страница 5 ] --

 АСМ изображения модифицированных антителами к-32

 АСМ изображения модифицированных антителами к-33

 АСМ изображения модифицированных антителами к E. coli-34

Рисунок 20 - АСМ изображения модифицированных антителами к E. coli (А) и к Salmonella (Б) поверхностей после их экспонирования в растворе, содержащем разрушенные фрагменты клеток E. coli c концентрацией (по целым клеткам) 109 клеток/мл

Для этого уменьшали концентрацию антигена в суспензии, в которую помещали изготовленную поверхность. На рис. 21 показано АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к E. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии фрагментов клеток E. coli, c исходной концентрацией клеток 102 клеток/мл. Как видно из АСМ изображения, на нем присутствуют частицы, которые и являются предположительно фрагментами бактерий. На рис. 21Б и 22В представлены сечения, проведенные по верхней и нижней пунктирным линиям на АСМ изображении. Верхнее сечение демонстрирует профиль бактериального нанофрагмента, а нижнее – глубину белковых слоев

на поверхности слюды (белок G + антитело), целостность которых была нарушена в ходе царапающего эксперимента кантилевером атомно-силового микроскопа.

 АСМ изображение поверхности слюды, активированной в-35

 АСМ изображение поверхности слюды, активированной в-36

 АСМ изображение поверхности слюды, активированной в-37

Рисунок 21 - АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к E. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с исходной концентрацией 102 клеток/мл (А); (Б) – сечение, проведенное по верхней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее профиль бактериального фрагмента; (В) – сечение, проведенное по нижней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее результат царапающего эксперимента

При дальнейшем уменьшении концентрации антигена его количество становится настолько маленьким, что вероятность даже специфического связывания очень мала. Поэтому требуется повысить эффективность специфического связывания, понизив при этом эффективность неспецифического. Для решения этой задачи модифицировали методику нанесения следующим образом. Во-первых, связывание антигена с аффинной поверхностью и последующую промывку стали проводить при pH 8,2 и температуре 32 °С, что благоприятствует специфическому связыванию. Во-вторых, промывку проводили погружением подложки в буфер с последующим вращением на шейкере в течение 10 мин, чтобы повысить эффективность очищения от неспецифически связавшегося с поверхностью материала за счет дополнительно возникающих гидродинамических потоков вблизи поверхности.

 АСМ изображения поверхностей, модифицированных белком G и-38

Рисунок 22 - АСМ изображения поверхностей, модифицированных белком G и антителами к E. coli, экспонированных в (А) суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с концентрацией (по целым клеткам) 100 клеток/мл, (Б) суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с концентрацией (по целым клеткам) 101 клеток/мл. Все изображения приведены к одному масштабу по высоте. Размеры изображений составляют 50 мкм. (В) – диаграмма значений v для образцов, полученных при экспонировании аффинных к E. coli поверхностей в суспензии E. coli с концентрациями 100 и 101 клеток/мл в сравнении с контрольным изображением

Для того, чтобы оперировать количественными критериями изучаемого взаимодействия, была разработана схема статистического анализа АСМ изображений. Сначала строится гистограмма распределения по высотам всех объектов на контрольном изображении и выбирается такая высота hmin, ниже которой лежит подавляющее большинство объектов. В дальнейшем анализируются лишь объекты, высоты которых превышают hmin. Такое отбрасывание более низких объектов позволит избежать анализа примесей. После этого для анализируемого изображения (с бактериальными фрагментами) строится распределение изображенных на нем объектов с высотами, большими hmin, по объемам и рассчитывается суммарный объем объектов V на АСМ изображении. Затем суммарный объем нормируется на площадь АСМ изображения v=V/S. Таким образом, величина v, имеющая смысл количества присоединившегося к поверхности материала на единицу площади, служит критерием для оценки наличия или отсутствия специфического связывания.

Разработанная методика оценки чувствительности аффинной поверхности была применена к антигену со сверхмалыми концентрациями – 100 и 101 клеток/мл. Соответствующие АСМ изображения приведены на рис. 22А, Б, а значения параметра v – на рис. 22В. Сравнение значений параметра v показывает, что чувствительность к определению малых концентраций становится значительно меньше, а для концентрации 100 клеток/мл значение v практически совпадает с контрольным.

Таким образом, была показана возможность специфической визуализации (идентификации) не только целых бактериальных клеток, но и их фрагментов с помощью АСМ.





Глава 4 Изучение токсичности нанообъектов

Для анализа бактерицидной активности были приготовлены 6 групп образцов с многофункциональными биоактивными наноструктурными покрытиями (МБНП). Их получали путем магнетронного напыления в атмосфере аргона или смеси аргона с азотом.

Грамотрицательные бактерии E. coli X-blue, E. coli 09, S. typhimurium и P. aeruginosa и грамположительные бактерии B. brevis и B. subtilis выращивали на твердой среде LB с 2 % агара в течение ночи в присутствии 6 образцов с МБНП. Не обнаружено разницы в росте бактерий, как в присутствии, так и в отсутствии образцов.

Кроме того, грамотрицательные бактерии E. coli X-blue и P. aeruginosa и грамположительные бактерии B. brevis и B. subtilis выращивали в жидкой среде LB. Исходная концентрация бактерий составляла 106 клеток/мл. Бактериальный рост анализировали по изменению оптической плотности при 625 нм. После 4 ч культивирования в контролях и опытах не было обнаружено разницы в росте. Таким образом, установлено, что образцы с МБНП не обладали бактерицидной активностью при культивировании бактерий как на твердых, так и в жидких питательных средах.

Анализ функциональной активности перитонеальных фагоцитов против клеток Y. pseudotuberculosis проводили в присутствии тех же 6-ти образцов с МБНП. Полученные результаты не выявили статистически достоверной разницы в бактерицидной активности макрофагов в присутствии всех протестированных образцов с МБНП. Это означает, что данные МБНП не изменяют бактериальный статус и системы защиты макроорганизма. Таким образом, данные МБНП могут использоваться для имплантантов, работающих под нагрузкой.

При анализе наноповерхностей титана, модифицированных одной из трех активных добавок - 10CaO + 2KMnO4, или 20%ZrO2 (TiZrCON), или наносеребром, показано, что после первых 3 ч культивирования оптическая плотность уменьшалась в 1,5 раза при инкубации образца с добавлением Ag с клетками E. coli по сравнению с оптической плотностью бактерий при отсутствии образцов в среде культивирования. Для остальных образцов бактерицидный эффект не был обнаружен.

Анализ фагоцитарной активности показал, что в присутствии образца (TiC+10CaO + 2KMnO4) в среде бактерицидная активность макрофагов не изменялась. В присутствии образца (TiC+20%ZrO2 (TiZrCON)) количество живых макрофагов уменьшалось вдвое, при этом оставшиеся (живые) макрофаги обладали нормальной фагоцитарной активностью. В присутствии образца Ag почти все макрофаги были повреждены, а оставшиеся живые макрофаги не обладали фагоцитарной активностью.

Таким образом, с помощью микробиологических приемов можно оценивать токсичность наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов направлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур. С этой точки зрения применение электрооптического и биосенсорного подходов изучения бактерий представляется весьма привлекательным благодаря нативности и чувствительности (для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а использование бионанотехнологических подходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом разрешении, но и увеличению чувствительности определения бактериальных клеток.

Электрооптический метод анализа клеток обеспечивает контроль электрофизических и связанных с ними морфологических и функциональных параметров бактерий. Интерпретация электрофизических параметров клеточных структур, фракционного состава популяции и морфометрии построена на взаимосвязи структуры и функций клетки. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с частицами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизических измерений. Электрооптическое исследование взаимодействия фаг-бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации микроорганизмов. На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения электрофизического метода анализа клеточных структур и определения гетерогенности клеточных популяций.

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов могут быть чувствительными, недорогими, с хорошими количественными и качественными характеристиками. Однако их применение требует обученного персонала и длительных временных процедур. Биосенсоры представляют собой разумную альтернативу традиционным методам, сокращая процедуру измерения и улучшая ее качество. В данной работе расширена область применения известных биосенсоров и разработаны новые биосенсорные элементы.

В представленной работе предпринята попытка идентификации микроорганизмов путем анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения бактерий. Первый – простой анализатор летучих компонентов (термостатируемый и для постоянного мониторинга) для определения бактерий и грибов по анализу газов над микробными культурами. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красителем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для определения бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюдается при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Биосенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержания данного углевода в среде культивирования. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения антибиотика авермиктина.

Применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосенсора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако микроорганизмы представляют собой сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала. Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазматической мембраны микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиоксидантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не изучено. Поэтому разработка такого типа биосенсора является перспективным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии – современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализировать такие процессы, как реакция гемагглютинации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наночастиц.

ВЫВОДЫ

1. Показана принципиальная возможность применения электроопти-ческого метода для анализа физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антителами или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов по выделению или поглощению ими летучих компонентов, из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля продукции антибиотика. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цитоплазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсемененностью коровьего молока.

6. Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анализа антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением действия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7. Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нано-фрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

8. Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использованы уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображения ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

9. Для поверхностей с многофункциональными биоактивными наноструктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоединений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Монографии, статьи в реферируемых журналах, главы в книгах международных издательств, патенты:



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.