WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами днк-технологии

-- [ Страница 1 ] --


На правах рукописи

ЗАРИПОВ ОЛЕГ ГАЯЗОВИЧ

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ПО ГЕНАМ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА И КАППА-КАЗЕИНА

МЕТОДАМИ ДНК-ТЕХНОЛОГИИ

Специальность: 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2010

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ахметов Тахир Мунавирович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович

кандидат биологических наук, доцент

Бабынин Эдуард Викторович

Ведущая организация: ФГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт племенного дела», Московская область,

Пушкинский р-н, п. Лесные Поляны.

Защита состоится 25 марта 2010 года в 13:00 ч. на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Автореферат разослан «___»________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

1. Общая характеристика работы

Актуальность. В связи с заинтересованностью перерабатывающих предприятий молочной промышленности в закупках качественного сырья для производства белковомолочной продукции, возникла потребность в привлечении современных молекулярно-генетических методов диагностики в животноводство для улучшения технологических свойств молока.

Процесс производства высококачественного сыра и творога возможен лишь при условии, что молоко направляемое на их выработку является сыропригодным. т.е. способно образовывать плотный казеиновый сгусток под действием сычужного фермента.

Для производства пастеризованных и стерилизованных продуктов молоко подвергается обработке с использованием высоких температур. Поэтому, проблема повышения термостабильности белков молока также является особо актуальной.

Опыт многих стран свидетельствует об использовании в животноводстве генетических маркеров, связанных с качественными признаками молочной продуктивности. Одними из таких маркеров являются гены бета-лактоглобулина и каппа-казеина (Л.А. Калашникова, 2003).

Ген каппа-казеин – один из немногих известных генов, однозначно связанный с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока. В-аллель гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке, более высоким выходом творога и сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока. Практика показывает, что высококачественные твёрдые сыры могут быть изготовлены только из молока, полученного от коров, имеющих генотип ВВ каппа-казеина. Хотя многими учеными установлено влияние гена бета-лактоглобулина на биохимические и технологические характеристики молока, нет единого мнения какой из аллелей, А или В наиболее предпочтителен.

В настоящее время генотипирование животных все больше связывают с работами в области ДНК-технологий, что позволяет идентифицировать генотипы молочных белков у маточного поголовья, производителей и молодняка (О.В. Костюнина, 2005).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и усовершенствование способов определения аллельного полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота на основе метода полимеразной цепной реакции.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

– Оптимизировать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований.

– Оптимизировать технику ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина; разработать новые способы проведения ПЦР.

– Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота с использованием ДНК-анализа.

– Оценить молочную продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

– Изучить качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

Научная новизна. Оптимизированы технические приемы выделения ДНК из крови и спермы и способы проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина» с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР.

Практическая значимость. Оптимизированные технические приемы пробоподготовки нуклеиновых кислот и ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина позволяют осуществлять достоверную оценку их аллельного полиморфизма.



Разработанные и предложенные подходы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР позволяют осуществлять эффективную экспресс-идентификацию аллельных вариантов АА, АВ, ВВ гена CSN3.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

– ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (2007-2009 гг.);

– всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007 г.);

– международной научно-практической конференции «Современные подходы развития АПК», посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных статей, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

– Технические приемы выделения нуклеиновых кислот и проведения ПЦР-ПДРФ, оптимизированные для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина, являются эффективными инструментами ДНК-анализа аллельного полиморфизма.

– Способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР, разработанные для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина в оптимизированной технике 2-х стадийной ПЦР, обеспечивают эффективную наработку специфичных ампликонов и позволяют осуществлять достоверную экспресс-идентификацию искомых генотипов.

– Определены частоты встречаемости желательных аллелей и генотипов по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина крупного рогатого скота, влияющие на молочную продуктивность, состав и физико-химические показатели молока;

– А-аллель гена бета-лактоглобулина оказывает положительное влияние на молочную продуктивность коров (удой, содержание белка, лактозы и сухих веществ в молоке); молоко таких коров характеризуется повышенной термостабильностью, тогда как В-аллель гена бета-лактоглобулина улучшает сыродельческие свойства молока.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 232 источника, в том числе 159 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования по теме диссертации проводились в период с 2006 по 2009 гг. на кафедре технологии животноводства ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», ООО «Дусым» Атнинского района, а также в ГУП головном племенном предприятии «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и оценки хозяйственно-полезных признаков у животных с разными генотипами бета-лактоглобулина, было отобрано в ООО «Дусым» 158 черно-пёстро х голштинских коров. Наряду с этим, для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и каппа-казеина были отобраны 70 быков-производителей в ГУП ГПП «Элита». В нашем исследовании использовались как чистопородные, так и помесные по голштинской породе быки-производители, все быки имели комплексный класс элита-рекорд. Оценку полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина проводили на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для дальнейшего исследования согласно принципа аналогов (А.И. Овсянников, 1976), по результатам генотипирования по гену бета-лактоглобулина были сформированы 3 группы черно-пёстро х голштинских коров. В первую группу включены первотёлки с генотипом бета-лактоглобулина ВВ (контрольная группа), во вторую – генотипом АВ, в третью – генотипом АА.

Наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета ООО «Дусым», то есть следующие документы: материалы годовых отчётов, материалы бонитировки, племенные свидетельства, документы первичного зоотехнического учёта (карточки коров и быков – форма 1-МОЛ, 2-МОЛ, а также акты контрольных доек).

Исследуемое поголовье крупного рогатого скота в течение проведения опыта находились в одинаковых условиях кормления и содержания, при этом были клинически здоровыми. Обслуживающий персонал (доярки, скотники и т.п.) в период проведения исследований был постоянным, что исключало влияние данного стрессового фактора на хозяйственно-полезные признаки животных.

Коров кормили по принятым в ООО «Дусым» рационам с учетом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (А.П. Калашников и др., 2003). Рационы кормления подопытных коров-первотелок были сбалансированы по 23 основным показателям. Основными кормами в зимний период являлись: силос из кукурузы, сенаж из однолетних викоовсяных смесей, сено кострецовое, которые коровы получали в одинаковом количестве. Корнеклубнеплоды, зерновые концентраты и минерально-витаминные добавки вводили в рацион в зависимости от живой массы и фактического удоя коров. Кормление животных в летний период обеспечивалось за счёт зелёного корма на пастбище и в виде зелёной подкормки при содержании в стойлах. Кроме того, давали концентрированные корма, в расчёте 300-350 г на 1 кг молока.





Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Спермодозы от быков-производителей поступали в замороженном виде.

Выделение ДНК из крови проводили разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Аммиачный способ. 100 мкл крови смешивали с 1000 мкл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 100 мкл 10 % раствора аммиака «25-370С» и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Комбинированный щелочной способ. 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при –200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Выделение ДНК из спермы проводили разработанным нами комбинированным щелочным способом.

Комбинированный щелочной способ. 50 мкл спермы растворяли в 500 мкл дистиллированной воды и осаждали при 10000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляли 50 мкл лизирующего раствора (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM EDTA-Na (pH 8,0), 2% SDS, 1 mg/ml протеиназы K, 10 mM 2-меркаптоэтанола), тщательно суспендировали на вортексе и инкубировали при 550С в течение 1 часа, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. К лизату добавляли 50 мкл 0,5 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 550С в течение 30 мин, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. Добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. Затем смешивали с 500 мкл 96% этанола осторожным покачиванием пробирки и выдерживали полученную смесь в морозильнике при –200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 10 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 15 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и повторяли процедуру термостатирования (600С, 15 мин). Полученный гомогенат инкубировали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой. Препараты ДНК хранили в условиях морозильника. Перед использованием пробы ДНК размораживали в термостате при 370С в течение 15 мин.

Анализ локуса гена бета-лактоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл с праймерами BLGP3: 5/-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3/ и BLGP4: 5/-CAGGACACCGG CTCCCGGTATATGA-3/, сконструированных Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 bp.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1буфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ТВЕ буфере.

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с серией отобранных праймеров:

1) Праймеры JК5: 5/-АТСАТТТАТGGCCATTCCACCAAAG-3/ и JКЗ: 5/-GC CCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/, сконструированные Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 350 bp.

2) Праймеры AB1: 5/-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-3/ и АВ2: 5/-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3/, сконструированные А Барросо и др. (A. Barroso et al, 1998) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 453 bp.

3) Праймеры К1: 5/-GAAATCCCTACCATCAATACC-3/ и К2: 5/-CCATCTA CGCTAGTTTAGATG-3/, сконструированные С. Камински (S. Kaminski, 1993) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 271 bp.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.