WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Ахмед влияние trichoderma почв египта и республики татарстан на отдельные параметры живых систем

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АТЕФ АБДЕЛЬМОХСЕН АБДЕЛЬРАХМАН АХМЕД

ВЛИЯНИЕ TRICHODERMA ПОЧВ ЕГИПТА И РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН НА ОТДЕЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ЖИВЫХ СИСТЕМ

03.01.04. – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2011

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Алимова Фарида Кашифовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Багаева Татьяна Вадимовна,

доктор биологических наук, профессор

Умаров Марат Мутагарович

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики КИББ НЦ РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2011 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.18, аудитория 211.

Факс 8(843)238-76-01,E-mail: atefnagi2000@yahoo.com,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан « _» ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук З.И. Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Грибы рода Trichoderma являются продуцентами метаболитов с высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Показана способность к выделению различных фитогормонов, органических кислот, аминокислот, витаминов и свыше 100 антибиотиков (Benitez et al., 2004, 2008; Druzhinina et al.,2011). Изоляты рода Trichoderma являются активными продуцентами гидролаз и способны к глубокой деструкции, как клеточных стенок растений, так и отдельных трудно расщепляемых растительных полисахаридов: целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина до мономерных форм и других полимеров (Claus, 2004; Harman et al., 2004; 2010; Harman, 2011).

Как известно, Trichoderma может продуцировать ряд микотоксинов: аламетицины, хризопанол, эмодин, эргоконин, глиотоксин, глиовирин, G-белки, харзианум А, гептелидовую кислоту, изоцианоциклопентены, конингинины A,B,C,G, арацельзин, сатурниспорин, сузукациллин, триходермин, трихорзианины А и В, трихотецены, трихотоксины, триховиридин и виридин (Uraguchi, Yamazaki, 1978; Anthony et al., 2009; 2010; Drizhinina et al., 2011). Выявлены виды Trichoderma, продуцирующие токсичные метаболиты, приводящие к летальному исходу мышей (Anthony et al., 2010). С другой стороны выделены новые вещества – циклотетрапептид и триходермине А, продуцируемые T.reesei обнаружили цитотоксическим эффектом против линии клеток человеческой меланомы A375-S2 (Sun et al., 2006).

Таким образом, в литературе по сельскохозяйственной и в меньшей степени медицинской биохимии накоплен обширный материал по влиянию метаболитов Trichoderma на микроорганизмы, растения, теплокровные организмы, возбудителей заболеваний, раковые клетки. Практически нет материала по влиянию на комплекс биохимических показателей на теплокровных животных.

По ГОСТу, принятому в России биопрепараты проверяются на онкогенность, генотоксичность, вирулентность, фитопатогены, растения и целый ряд других биологических параметров.

Вследствие этого каждый биопрепарат должен проходить такую же длительную проверку экологической безопасности, как и химические препараты.

В последние 30 лет биопрепараты на основе Trichoderma являются одним из наиболее востребованных в Республике Татарстан. Однако спектр областей возможного применения метаболитов этого вида неуклонно расширяется и это требует дополнительных исследований.

Цель работы: Оценка биобезопасности и биологической активности метаболитов грибов рода Trichoderma из почв Египта и РТ к растениям, микроорганизмам, клеткам и животным.

Основные задачи исследования:

  1. Охарактеризовать тип взаимодействия T. asperellum 551из РТ и T.harzianum 3 из Египта с микромицетами рода Fusarium, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori.
  2. Определить влияние микромицетов рода Trichoderma на токсинообразование Aspergillus flavus.
  3. Выявить эффективность действия фармацевтического фунгицида амфотерицина и метаболитов Trichoderma на некоторые физиологические параметры модельного вида Aspergillus awamori.
  4. Оценить влияние метаболитов Trichoderma на жизнеспособность клеток линии HeLa.
  5. Исследовать биохимические, гематологические, гистологические, иммунологические показатели мышей стока CD-1 на фоне метаболитов Trichoderma и индуктора опухолеобразования пирена.
  6. Показать влияние метаболитов Trichoderma на рост и продуктивность некоторых сортов кукурузы.

Научная новизна. Впервые проведено сравнение влияния метаболитов Trichoderma asperellum 551 и Trichoderma harzianum 3 на рост и продуктивность районированных сортов кукурузы РТ и Египта на различных типах почв.



Впервые показано, что метаболиты Trichoderma asperellum 551 и Trichoderma harzianum 3 не обладают онкогенным действием и подавляют образование опухолей, индуцированных пиреном.

Метаболиты Trichoderma asperellum 551 и Trichoderma harzianum 3 оказывают антагонистическое действие на патогенные грибы и регулируют синтез охратоксина А и афлотоксина A. flavus.

Практическая значимость. Полученные результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и могут быть использованы для дальнейшей сертификации биопрепаратов на основе исследуемых штаммов T.asperellum 551 на базе биозавода ООО НПИ Биопрепараты в РТ, а на основе T.harzianum 3 на биозаводе в Египте.

Разнонаправленное действие метаболитов Trichoderma на токсинообразование A. flavus указывает на необходимость введения нового пункта контроля биопрепаратов на основе микромицетов.

Результаты могут быть использованы в учебном процессе в рамках дисциплин «Биотехнология», «Биологически активные вещества микробного происхождения».

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ "Выявление взаимосвязи сукцессий живых организмов и эволюционных изменений биосферы" раздел № 1 Темплана КФУ на период с 1.01.2011 по 31.12.2013 г. Девиз – РНП-23.Гранты РФФИ 11-04-00805-а «Микробные сообщества почв древних ландшафтов лесостепи Поволжья» 2011-2013,11-04-01731-а «Влияние тяжелых металлов на экологическое состояние почв при синергетическом эффекте загрязнения антропогенных ландшафтов 2011–2012». Все эксперименты проводились в лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии, кафедры биохимии, биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета, Казань. Полевые испытания проводились на серой лесной почве Лаишевского района 2008 году и черноземе Черемшанского района в 2009 году РТ. Личное участие заключалось в разработке темы исследований, выборе объектов для изучения, проведении экспериментов, обработке полученных результатов, их анализ и интерпретация, подготовка статей к публикации (написание и редактирование), а также их обсуждение с рецензентами. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Масс – спектроскопию проводили в лаборатории к.ф.-м.н.я. Волошина А.В., отдела аналитической спектроскопии Федерального центра коллективного пользования физико - химических исследований веществ и материалов Приволжского федерального округа. Получены положительные отзывы от предприятий по предварительным опытам использования опытных партий биопрепаратов на основе штаммов Trichodermа в сельскохозяйственной биотехнологии РТ.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Метаболиты грибов рода Trichoderma, выделенные из почв Египта и РТ, оказывают разнонаправленное действие на выработку охратоксина А и афлатоксина В1 патогеном A. flavus в зависимости от вида микромицета.
  2. Метаболиты T.asperellum 551 ингибируют индуцированное пиреном образование опухолей в печени и коже у мышей и оказывают цитотоксическое действие на клетки HeLa в опытах in vitro.
  3. Наибольшую антагонистическую активность в отношении фитопатогена рода Fusarium oxysporum оказывает миромицет, выделенный из почв Республики Татарстан

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

  1. «Становление и достижения биохимической школы казанского университета» (Казань, КФУ, ноябрь 2009),
  2. «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, МГУ, декабрь 2009),
  3. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2010),
  4. «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», I научно-практическая интернет-конференция (ноябрь 2010),
  5. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2011),
  6. «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», II научно-практическая интернет-конференция (Казань, КФУ, ноябрь 2011),
  7. «Международная конференция» по вопросам сельского хозяйства и ирригации в странах бассейна Нила», (факультет сельского хозяйства, Университет Минья, г.Эль-Минья, Египет, 26-29 марта, 2012).

Публикации. По данной теме опубликовано 8 работ в сборниках международных и всероссийских конференций, опубликованы 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Основное содержание работы изложено на 175 страницах машинописного текста, диссертация иллюстрирована 9 таблицами, 62 рисунком. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 50 отечественных и 202 зарубежных публикаций.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1.1.Биологические образцы.

1.1.1.Использованные микроорганизмы. Trichoderma asperellum 551, выделенный из почв Республики Татарстан, Trichoderma harzianum 3, выделенный из почв Египта, Aspergillus awamori 66А, предоставленный лабораторией Эдинбургского университета, Aspergillus flavus, предоставленный музеем кафедры микробиологии МГУ, Fusarium oxysporu, выделенный из семян кукурузы и почв РТ. Промышленный биопрепарат «Мизорин», созданный на основе бактерий рода Bacillus, был получен от ООО «НПИ «Биопрепараты», Казань, Россия.





1.1.2.Клетки HeLa. 1105 клеток/мл поддерживались на минимальной среде (MEM), при 37C во влажной атмосфере с 5% CO2.

1.1.3.Подопытные животные. Взрослые самцы белых мышей стока СD-1 с массой тела 21 г (Питомник лабораторных животных «Пущино» ФИБХ РАН).

1.1.4.Семена кукурузы. 8 сортов семян отечественной кукурузы (Россия): Краснодарский 2007, Краснодарский 2008, Поволжский, Росс 145, Российская-1, Россбелая-1, Молдавский 218 и 1 сорт зарубежной - Giza baladi (Египет).

1.2.Методы исследования.

1.2.1.Морфолого-культуральные свойства изучали на картофельно-глюкозном агаре (КГА), на среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы, на специальном питательном агаре (SNA) (по Samuels et al., 1998). Для выращивания использовали как агаризованные, так и жидкие среды.

1.2.2.Размеры объектов замеряли с помощью окуляр–микрометра, так же с помощью программы Paint.

1.2.3.Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на средах Чапека и КГА (Семонян и Мамиконян, 1982).

1.2.4. Определение ксиланазной, протеазной и целлюлазной активностей изолятов Trichoderma проводили по методу окрашивания редуцирующих сахаров (Konig, 2002).

1.2.5. Определение фитотоксичности культуральной жидкости проводили на 8 сортах кукурузы (Samuels, 1999).

1.2.6. Полевые опыты, по оценке влияния исследуемых биопрепаратов, произведённых на основе штаммов T.551 и T.3 и промышленного биофунгицида Мизорин, проводили на серой лесной почве Лаишевского района и черноземе Черемшанского района РТ.

1.2.7. ИФА методом осуществлялась оценка влияния действия метаболитов T. 551 и T.3 на выработку афлатоксина B1 и охратоксина А, которые синтезируются токсинобразующим микромицетом Aspergillus flavus. Оптическую плотность измеряли при 450 нм на спектрофотометре.

1.2.8.Воздействие амфотерицина на клеточный ответ A. awamori оценивали после культивирования А. аwamori при 30оС в жидкой среде Фогеля с добавлением сахарозы (среда ВС) и на плотной среде (2% агар) того же состава, обогащенной глюкозой (среда ОСГ) (Nelson et al., 2004).

1.2.9.Цитотоксическую активность метаболитов Trichoderma оценивали in vitro на клетках линии HeLa. Проводилось совместное культивирование в течение 30 и 60 мин при 37°С. После инкубации клетки окрашивали трипановым синим. Жизнеспособность клеток HeLa рассчитывали в процентах живых клеток по отношению к общему числу.

1.2.10.Количественное определение элементарного состава в клетках и культуральной жидкости микромицетов проводили в соответствии со стандартами РФ согласно методическим указаниям (МУК 4.1.1483-03). Измерения осуществляли на масс-спектрометре Elan DRC II (PerkinElmer), образцы предварительно подвергали микроволновой подготовке и системе MWS-3 (Berghof) при температуре 150оС, в присутствие азотной кислоты (1мл) и бидистиллированной воды (4 мл).

1.2.11.Определение онкогенности метаболитов Trichoderma in vivo проводили на фоне стимуляции опухолеобразования пиреном по комплексу: гематологических, гистологических, иммунологических и биохимических показателей. Животные содержались согласно международным этическим нормам. Животные получали воду и корм ad libitum. Макрогруппа из 25 мышей была разделена на 5 групп, которым вводили культуральную жидкость T. asperellum (1.25мл / 100 г вес тела) и пирен (5мг / 100 г вес тела). В контрольной группе мышей инъецировали внутрибрюшинно каждые 24 ч в течение 14 сут стерильной водой для инъекций. Мышам второй группы сначала вводили каждые 24 ч в течение 7 сут культуральную жидкость Trichoderma, затем каждые 24 ч в течение 7 сут пирен. Третей группе сначала каждые 24 часа в течение 7 суток вводили пирен, затем каждые 24 часа в течение следующих 7 суток – культуральную жидкость. Четвертая группа была подвергнута действию пирена в течение 7 суток. И пятую группу инъецировали только культуральной жидкостью в течение 7 суток.

Общий вес мышей определяли в течение 14 дней ежедневным взвешиванием до принятия пищи. После окончания эксперимента определяли вес отдельных органов мышей (печени, почек, селезёнки, яичек). Затем определяли отношение массы органов к общей массе мышей.

1.2.12.Гематологическое исследование проводили методом подсчёта количества красных кровяных телец, уровня гемоглобина, гематокрит (объём форменных элементов крови), среднего объёма эритроцита (MCV), гемоглобина (MCH) и гемоглобина в эритроците (MCHC), используя ЭДТА-содержащие пробирки. Подсчёт красных кровяных телец осуществляли с помощью камеры Горяева в физиологическом растворе (0,9% NaCl) (Dacie, Lewis, 1991). Процент гемоглобина определяли в соответствии с рекомендациями Международного Комитета Стандартизации в Гематологии (ICSH,1967), используя коммерческий набор Randox Company (Великобритания). Гематокрит определяли центрифугированием клеток в гепаринизированных гематокритных пробирках (капиллярные пробирки с внутренним диаметром 1мм и 7,5см длиной) в течение 5 минут 15000rpm (Dacie, Lewis, 1991). MCV, MCH и MCHC рассчитывались, исходя из формул:

,

где Fl – фемтолитр = 10-15, Pg – пикограмм = 10-12.

1.2.13.Иммунологическое исследование проводили методом подсчета белых кровяных телец с помощью камеры Горяева, используя специальный раствор Тюрка, а также дифференциальный подсчёт лейкоцитов, число которых рассчитывали согласно рекомендациям Dacie и Lewis (Dacie, Lewis, 1991).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.