WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Биологические свойства бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Иванова Елена Валерьевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИФИДОБАКТЕРИЙ И ИХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МИКРОСИМБИОНТАМИ

КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА

03.02.03 – «Микробиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Оренбург – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в ГУ «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН»

Научный руководитель:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор ГОУ ВПО

«Оренбургский государственный

Университет» Брудастов Юрий Авенирович

кандидат биологических наук,

доцент ГОУ ВПО

«Тюменская государственная

медицинская академия Федерального

агентства по здравоохранению

и социальному развитию» Тимохина Татьяна Харитоновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится « » апреля 2010 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, зал заседаний диссертационного совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА

Автореферат разослан «___» ______________ 2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Основу нормальной микрофлоры пищеварительного тракта здорового человека составляют облигатно-анаэробные микроорганизмы, доминирующими представителями которых являются бифидобактерии (Гончарова Г.И., 1970, 1982, 1987; Hold G.L., 2002; Reyed M. R., 2007).

В настоящее время охарактеризованы таксономические, морфологические, физиологические особенности бифидобактерий (Новик Г.И., 2005; Bezkorovainy A., 1986; Asano T., 2005; Hadadji M., 2005), а также изучены вопросы качественного и количественного состава бифидобактерий кишечника в зависимости от возраста, характера питания, климатической зоны проживания человека также изучены (Шкопоров А.Н. с соавт., 2006; Амерханова А.М., 2009; Gavini F. et al., 2001; He F. et al., 2001). Определена роль бифидобактерий в реализации колонизационной резистентности толстого кишечника, описано их участие в различных метаболических процессах в организме человека (обмен витаминов, минералов, желчных кислот) (Шендеров Б.А., 2002; Cheikhyoussefa A., 2008). Имеются отдельные сведения по изучению факторов персистенции бифидобактерии (Елагина Н.Н., 2001; Глухова Е.В., 2009).

Вместе с тем, отсутствуют работы по комплексной оценке биологических свойств фекальной бифидофлоры в зависимости от вида бифидобактерий при различных состояниях микробиоценоза кишечника человека. Не выявлена роль и участие персистентного потенциала, антагонистической активности и биоплёнкообразования микросимбионтов (бифидофлоры и УПМ) в качестве одного из возможных механизмов формирования ассоциативного симбиоза, так как в последнее время инфекция рассматривается в качестве модельной системы этого явления (О.В. Бухарин, 2009).

Указанные моменты и предопределили тематическую направленность наших исследований, которые могли бы способствовать раскрытию патогенетических механизмов межмикробных взаимоотношений нормофлоры с УПМ кишечника и изысканию новых подходов для дальнейшей работы по отбору эффективных пробиотиков для коррекции дисбиозов кишечника.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение видового состава и биологических свойств бифидобактерий и их взаимодействия с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определить видовой состав и биологические свойства (антилизоцимную, антилактоферриновую, антииммуноглобулиновую и биопленкообразующую активности) фекальной бифидофлоры в норме и при дисбиозах кишечника человека.

2. Изучить антагонистическую активность бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе кишечника человека и оценить влияние условно-патогенной микрофлоры на антагонизм представителей Bifidobacterium sp. strain CS.

3. Оценить в условиях in vitro взаимное влияние экзометаболитов бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их антилизоцимную активность и способность к образованию биоплёнок.

Новизна исследования

Выявлены различия в видовом составе бифидофлоры в зависимости от состояния микробиоценоза. При эубиозе в I группе (дети до 1 года) превалировал вид B. bifidum, во II группе (дети после 1 года и взрослые) - B. bifidum и B. longum. При дисбиозе отмечено увеличение видового состава бифидофлоры (6 видов) по сравнению с эубиозом (3-4 вида). В I группе при дисбиозе кишечника не удалось выявить доминирующий вид среди бифидобактерий, во II группе превалировал вид B. adolescentis.



Впервые выявлены распространённость и выраженность антилактоферриновой активности и плёнкообразующей способности культур Bifidobacterium sp. strain CS, которые, также как антилизоцимная активность, положительно коррелировали с показателем микробной обсеменённости бифидобактерий. Изучена пенетрантность и экспрессивность способности бифидобактерий инактивировать секреторный иммуноглобулин А, отрицательно коррелировавший с ПМО бифидобактерий. Определены отличия в распространенности и выраженности персистентных свойств (АЛА, АЛфА, ПО, АsIgA) представителей рода Bifidobacterium в зависимости от вида бифидобактерий и состояния микробиоценоза кишечника человека. При дисбиозе толстого кишечника у штаммов бифидобактерий отмечено снижение антилизоцимной, антилактоферриновой, плёнкообразующей активностей и усиление способности инактивировать секреторный иммуноглобулин А.

Пенетрантность и экспрессивность антагонистической активности бифидобактерий варьировала у различных видов, и была выше у штаммов, изолированных при эубиозе, чем у культур, выделенных при дисбиозе кишечника. Способность бифидобактерий ингибировать рост УПМ снижалась в ряду B.longum > B. adolescentis > B. bifidum.

Установлено, что клеточные экстракты и экзометаболиты микроорганизмов-симбионтов изменяли антагонистическую активность представителей Bifidobacterium sp. strain CS. Влияние компонентов условно-патогенных микроорганизмов на антагонистическую активность бифидобактерий было различным: усиление антагонизма наблюдалось под действием экзометаболитов и клеточных экстрактов S. aureus, Kl. pneumoniae и C. albicans; снижение антагонистической активности - при влиянии экзометаболитов E. faecium и компонентов E. coli lac-.

Бифидобактерии и условно-патогенные микроорганизмы изменяли антилизоцимную активность и плёнкообразующую способность ассоциантов преимущественно в двух направлениях. Синергидный тип межмикробных взаимоотношений был характерен для ассоциации бифидобактерий с индигенными представителями микрофлоры толстого кишечника (E. faecium и E. coli lac+), где в 60-75 % случаев отмечена стимуляция как АЛА, так и плёнкообразования у обоих ассоциантов. Антагонистический тип взаимоотношений нормофлоры (бифидобактерий) имел место с транзиторными представителями УПМ (E. coli lac-, Kl. pneumoniae, S. aureus, C. albicans), у которых в 67 - 89 % отмечено взаимное снижение антилизоцимной активности и плёнкообразования микросимбионтов.

Практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о роли видового состава и биологических свойств бифидобактерий в формировании ассоциативного симбиоза в условиях микробиоценоза кишечника.

Выявленные особенности регулирующего воздействия анаэробных микроорганизмов (бифидобактерий) на факторы персистенции условно-патогенной микрофлоры могут быть использованы в качестве дополнительных критериев отбора эффективных пробиотиков с целью коррекции дисбиоза кишечника. Способность клеточных экстрактов и экзометаболитов условно-патогенной флоры стимулировать антагонистическую активность бифидобактерий открывает перспективу для создания синбиотиков.

Предложенные методические подходы по изучению межмикробных взаимодействий могут быть рекомендованы для работ микроэкологического профиля.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Бифидобактерии, изолированные из кишечной микробиоты, имеют различия в видовом составе и экспрессивности факторов персистенции, антагонистической активности и биоплёнкообразования, зависящие от возраста и состояния микробиоценоза кишечника обследуемых лиц.
  2. Метаболиты и клеточные экстракты микроорганизмов-симбионтов изменяют их биологические свойства, определяя межмикробные взаимоотношения бифидофлоры и УПМ в условиях ассоциативного симбиоза кишечника человека.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: I Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009); V и VI Всероссийских конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 50 отечественных и 100 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 10 таблицами и 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

При проведении исследования было выделено 163 фекальных штамма аэробных и анаэробных микроорганизмов, изолированных от пациентов в возрасте от 1 месяца и до 60 лет при обследовании на дисбиоз кишечника. Деление обследуемых лиц на возрастные группы для оценки состояния микрофлоры проводили в соответствии с приказом Минздрава РФ № 231 "Об утверждении отраслевого стандарта "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника". Согласно приказа все обследуемые лица были разделены на 2 основные группы: I группа – дети до 1 года, II группа – дети от 1 года и взрослые. У 36 лиц был установлен эубиоз кишечника, у 61 пациента был выявлен дисбиоз кишечника I-III степени.





От обследуемых выделено 97 штаммов бифидобактерий: B. longum - 18 штаммов, B. infantis – 9 культур, B. breve – 11 изолятов, B. adolescentis – 22 штамма, B. bifidum – 26 культур, B. animalis – 7 изолятов, B. dentium - 3 штамма, B. pseudolongum – 1 штамм; 42 штамма энтеробактерий: E. coli – 18 штаммов, C. freundi, E.cloacae, M. morganii, Kl. pneumoniae по 6 штаммов; 12 культур дрожжевых грибов: C. albicans и R.rubra по 6 штаммов; 6 изолятов S. aureus и 6 культур E. faecium.

Исследование микробиоценоза кишечника осуществлялось в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов-симбионтов проводилась общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных свойств (Биргер М.О. и др., 1982). Биохимический профиль изучаемых культур микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия).

Антилизоцимная, антилактоферриновая и антииммуноглобулиновая активности определялись по методикам Бухарина О.В. с соавторами (1999, 2005). Образование биоплёнок оценивали по способности штаммов бифидобактерий к адгезии на поверхности 96-луночной полистероловой поверхности стерильного планшета (O`Toole G., 2000). Антагонистическую активность штаммов бифидобактерий определяли по отношению к условно-патогенным индикаторным бактериям с помощью метода отсроченного антагонизма в агаре по Muriana P. и Klaenhammer T. (1987).

Исследование биологических свойств бифидобактерий и условно-патогенных представителей кишечной микрофлоры в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности) микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон (Елагина Н.Н., 2001; Перунова Н.Б., 2003).

Данные по видовому составу и биологическим свойствам бифидофлоры кишечника были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат» (Гланц С., 1999) путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m). Взаимосвязь между ПМО и биологическими свойствами кишечной бифидофлоры анализировали с использованием программы «корреляционный анализ» программы Microsoft Excel 1997, при этом достоверность выявленных связей определяли по достижению коэффициентами “r” пороговых величин, соответствующих размерам анализируемой выборки и заданной значимости достоверности (р<0,05).

Данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их биологические свойства были подвергнуты статистической обработке непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что при микроэкологических нарушениях в кишечнике наблюдается перестройка качественного и количественного состава фекальной бифидофлоры. При эубиозе показатель микробной обсеменённости (ПМО) представителей рода Bifidobacterium в микробиоценозе кишечника в I группе лиц составлял в среднем 10,7±0,2 lg КОЕ/г, во II группе обследуемых - 9±0,05 lg КОЕ/г. При дисбиозе наблюдалось снижение содержания бифидобактерий у детей первого года жизни до 8,1±0,4 lg КОЕ/г, в старшей возрастной группе – до 7,2 ±0,2 lg КОЕ/г.

При анализе видового состава бифидофлоры (рис. 1) при эубиозе кишечника выявлено, что у обследуемых лиц I группы штаммы принадлежали к трём видам: B. bifidum, B. infantis и B. breve, в то время как бифидофлора II группы характеризовалась присутствием четырёх видов: B. longum, B. bifidum, B. adolescentis и B. breve. Наиболее часто при эубиозе кишечника у обследуемых лиц в I группе встречались культуры бифидобактерий, относящиеся к виду B. bifidum (50 %), во II группе - доминировали B. longum (41 %) и B. bifidum (32 %). При дисбиозе кишечника видовой состав представителей Bifidobacterium sp. strain CS был более разнообразен (6 видов), тогда как при эубиозе выявлено 3-4 вида. У детей до 1 года чаще изолировали B. adolescentis, B. animalis, B. longum, B. bifidum, B. infantis и B. breve, а у лиц после 1 года и взрослых - B. adolescentis, B. longum, B. bifidum, B. animalis, B. dentium и B. pseudolongum. Среди видов бифидобактерий, изолированных при дисбиозе, в I группе не удалось выявить доминирующий вид, во II группе отмечалось превалирование B. adolescentis (44 %).

Сравнительная оценка данных по видовому составу бифидофлоры при эубиозе и дисбиозе кишечника человека показала следующие отличия: при эубиозе кишечника характерно наличие 3-4 видов бифидобактерий, среди которых превалировали B. bifidum и B.longum. При дисбиозе кишечника наблюдалось увеличение количества видов бифидобактерий до 6 и доминирование культур B. adolescentis.

 Видовой состав бифидофлоры кишечника-0

Рис. 1 - Видовой состав бифидофлоры кишечника у обследуемых разных возрастных групп при эубиозе (A) и дисбиозе (Б) кишечника

I группа – дети до 1 года; II группа – дети после 1 года и взрослые



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.