WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Семёнов

Александр Васильевич

Характеристика антагонистической активности бактерий

при межмикробных взаимодействиях

03.00.07 – «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оренбург – 2009

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза

Уральского отделения Российской Академии Наук

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор, кафедра микробиологии ОрГМА Усвяцов Борис Яковлевич

Кандидат биологических наук

доцент, лаборатория природных микробиоценозов

ИКВС УрО РАН Яценко-Степанова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится «30» апреля 2009г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460014, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии

Автореферат разослан «27» марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Антагонистическая активность бактерий определяет выживание микроорганизмов при их взаимодействии в бактериальных ассоциациях, которые являются частью ассоциативного симбиоза – многокомпонентной системы, где кроме хозяина и доминантного микросимбионта учувствуют ассоциативные симбионты, выполняющие функцию формирования и обеспечении стабильности и продуктивности симбиоза (Бухарин и др., 2007). При этом антагонистическая активность доминантной микрофлоры регулируется ассоциативными бактериями.

Известно, что продукция бактериями различных антимикробных веществ – антибиотиков, бактериоцинов, литических ферментов подвержена микробной регуляции (Егоров, 2004, Barefoot et al., 1994, Bronneke, Fiedler, 1994) и определяет взаимодействие между микроорганизмами в ассоциациях, способствуя стимуляции бактериального антагонизма (Вахитов, 2007, Barefoot et al., 1994, Mearns-Spragg et al., 1998, Yan et al., 2003, Dubuas, Haas, 2007). К сожалению, антагонистические свойства бактерий при межмикробных отношениях недостаточно охарактеризованы, не ясна роль индукторов антагонизма – феромонов, гомосеринлактонов, клеточных стенок - при реализации отношений антагонистического типа на межвидовом уровне, не определено для большого числа антимикробных факторов связь между изменением их продукции и выраженностью антагонистской активности. К малоизученным явлениям следует отнести биотическую регуляцию антагонизма бактерий, обусловленного литическими ферментами – -гликозидазами, пептидазами, амидазой. Открытым остается вопрос и о практическом использовании регуляторов антагонистической активности бактерий в формировании колонизационной резистентности хозяина.

Изучение этих вопросов открывает перспективы выявления новых механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа, через регуляцию антагонизма автохтонных бактерий ассоциативными микроорганизмами. Исследования по стимуляции антагонизма позволят разработать подходы к созданию новых лечебно-профилактических биопрепаратов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования - изучить влияние микроорганизмов на антагонистическую активность бактерий и продукцию ими антимикробных веществ.

Задачи:

  1. Оценить существующие методы исследования антагонистической активности бактерий и разработать методику для определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий.
  2. Исследовать влияние метаболитов и фрагментов клеточной стенки бактерий на антагонистическую и -гликозидазную активности исследуемых антагонистов.
  3. Изучить в условиях in vitro влияние микроорганизмов-ассоциантов на антагонистическую активность бактерий-пробиотиков.

НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработан количественный метод исследования антагонистических отношений между бактериями, основанный на сравнительной оценке антагонизма штамма, выросшего в присутствии / отсутствии клеточных компонентов культуры-регулятора, пригодный для изучения межвидовых взаимодействий между различными микроорганизмами (заявка на получение патента РФ 2008100982/13А). Показано, что бактериальный антагонизм подвержен регуляции со стороны микроорганизмов различных таксонов, где модулирующим антагонизм эффектом обладают как метаболиты, так и пептидогликаны бактерий.

Обнаружено неизвестное ранее свойство бактериального пептидогликана – регулировать внутриродовой и межродовой антагонизм прокариот в условиях межмикробных отношений.

При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от чувствительных культур, связанная со стимулирующим действием метаболитов и пептидогликанов чувствительных бактерий.

Изучение отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой под воздействием метаболитов и пептидогликанов различных микроорганизмов, выявило индифферентное, стимулирующее и ингибирующее действие бактерий-регуляторов. Обнаружена способность бактерий-регуляторов изменять изначально наблюдаемый антагонизм от полного ингибирования признака до ростстимулирующего эффекта.



Регуляция антагонистической активности осуществляется за счет продукции антимикробных веществ, в частности, литических ферментов. Выявлена связь между изменением антагонистической и -гликозидазной активностями микроорганизмов под воздействием метаболитов и пептидогликанов бактерий-регуляторов.

На основе стимуляции антагонизма при межмикробных взаимодействиях предложены критерии отбора пробиотических штаммов и предложена модель создания поликомпонентных пробиотиков. В условиях in vitro доказана возможность использования пептидогликанов и/или метаболитов патогенных и пробиотических бактерий в качестве пребиотиков, пригодных для стимуляции антагонистической активности представителей нормальной микрофлоры человека и штаммов-пробиотиков.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработанный метод определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий может быть рекомендован для научно-исследовательской работы лабораторий микробиологического профиля при изучении бактериальных механизмов колонизационной резистентности и поиска новых биопрепаратов - стимуляторов антагонизма.

Разработаны критерии отбора бактерий для создания комбинированных биопрепаратов, состоящих из антагониста и его стимулятора. На основе взаимной стимуляции антагонистических свойств микроорганизмов предложена новая комбинация бактерий из известных пробиотиков, превосходящая по антагонистической активности монопрепараты: E. сoli М-17 и E. faecium.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Антагонистическая активность бактерий в условиях микросимбиоценоза - результат взаимодействий между микроорганизмами, где активный штамм выполняет роль продуцента антимикробных веществ, а ассоциативные бактерии определяют возможность и выраженность проявления антагонизма.

2. Бактериальный пептидогликан – регулятор межмикробных взаимодействий в системе «прокариот-прокариот».

    1. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований доложены на международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и эксперименральных системах» (Москва, 2004), V Всероссийской конференции “Персистенция микроорганизмов” (Оренбург, 2006), III Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы экологии микроорганизмов» (Пермь, 2007).

          1. ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, три главы собственных исследований, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 35 отечественных и 200 иностранных научных источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами, 18 рисунками и 1 фото.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили штаммы-антагонисты различных таксонов, выделенных из женского репродуктивного тракта: 12 штаммов Enterococcus faecalis, 5 штаммов Lactobacillus casei, 3 штамма Corynebacterium minutissium и 2 штамма Staphylococcus aureus. Также использовали антагонистически активные культуры из коллекции ИКВС УрО РАН – 2 вагинальных изолята L. acidophilus, 10 штаммов Staphylococcus aureus, выделенные из носовой полости, 2 штамма Bacillus subtilis и 6 штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенные из различных биотопов и штаммы-пробиотики Escherichia coli M-17 («Колибактерин»), L. plantarum 8РА-3 («Лактобактерин»), Bifidobacterium longum («Бифиформ»), Enterococcus faecium («Бифиформ»), B. subtilis №534 («Споробактерин»). Для выделения и идентификации микроорганизмов использовали общепринятые методы. Культивирование бактерий проводили на среде Мана-Рогоза-Шарпа (МРС, «HiMedia») и 1,5% пептонной воде (ПВ; НПО «Питательные среды») при 37 0С. Культуральную жидкость и клеточные экстракты бактерий получали традиционными способами, которые обеззараживали хлороформом.

Пептидогликаны бактерий получали по Герхардту (Методы бактериологии…,1984), с дополнительной обработкой микробной биомассы смесью этилового спирта и хлороформа, щелочью и ацетоном. Ацетоновый раствор фрагментов клеточной стенки исследуемой культуры высушивали при комнатной температуре, затем ресуспендировали необходимое количество в жидкой питательной среде (MРС для лактобактерий и ПВ для остальных микроорганизмов) и обеззараживали автоклавированием при 0,5 атм, 30 минут. При получении фрагментов пептидогликана из грамотрицательных бактерий, перед всеми описанными операциями, размороженную биомассу бактерий обрабатывали горячим (65 0С) 10% водным раствором фенола.

Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали методы прямого антагонизма по Murray (1950), в модификации Усвяцова (1967) и отсроченного антагонизма по Frederiq (1957). Для количественной оценки признака использовали метод Бухарина с соавт. (патент РФ № 2175673).





Антагонистическую активность штамма выражали двумя способами – через % угнетения и степень прироста тест-культуры при культивировании её с культуральной жидкостью антагониста.

Определение общей -гликозидазной активности бактерий проводили с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты (Miller, 1959) по увеличению количества восстанавливающих сахаров при гидролизе субстрата - клеточных стенок микроорганизмов (в работе M. luteus №2665). Определение -N-ацетилглюкозаминидазной активности бактерий (КФ 3.1.2.52) проводили микрометодом, с использованием хромогенного субстрата N-ацетилглюкозамина, меченого по -1,4-гликозидной связи паранитрофенолом (Fermor et al., 1991). Наличие у штамма лизоцимной активности (КФ 3.1.2.17) диагностировали в случае положительной реакции на -гликозидазную активность, на фоне отсутствия активности аминидазы.

Определение активности пептидаз или N-ацетилмурамоиламидазы (КФ 3.1.2.28) бактерий проводили с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола (Ghuysen, 1966) по увеличению количества свободных аминогрупп при гидролизе субстрата - клеточных стенок микроорганизмов (в работе M. luteus №2665).

Ферментную активность выражали в мкмоль/ч*мл - мкмоль продукта, образующегося за 1 час инкубации при 37 0С в 0,025М натрий-калий-фосфатном буфере (рН=6,2) субстрата с культуральной жидкостью исследуемой культуры, в пересчете на 1 мл.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием параметрических методов вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Все эксперименты проводили в двух повторностях при трехкратном воспроизведении.

Результаты исследования и их обсуждение

Существующие методы исследования микробной регуляции бактериального антагонизма основаны на принципе сокультивирования взаимодейсвиующих бактерий (Barefoot et al., 1994, Maldonado et al., 2004, Mearns-Spragg et al., 1998, Yan et al., 2003, Dubuas, Haas, 2007). Но эти методы оказались малопригодны для изучения отношений между бактериями с различными требованиями к питанию, между тремя и более видами микроорганизмов. Это обстоятельство определило необходимость разработки нового метода исследования регуляции антагонистических свойств бактерий, с учетом указанных недостатков. Используя известные данные о наличии у бактерий регуляторных молекул (Хохлов, 1988, Brurberg et al., 1997, Taga, Bassler, Whitehead, 2001, Bodman, Willey, Diggle, 2008), нами был разработан количественный метод исследования антагонистических отношений между бактериями, основанный на сравнительной оценке антагонизма штамма, выросшего в присутствии / отсутствии клеточных компонентов культуры-регулятора, пригодный для изучения межвидовых взаимодействий между различными микроорганизмами.

При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от чувствительных культур. Установлено определяющее значение клеточных компонентов тест-культуры M. luteus в проявлении антагонистической активности E.faecalis, C.minutissium и S.aureus в отношении микрококка (рис. 1). Другими словами, выраженная продукция антимикробных веществ активными культурами происходила только при их культивировании с чувствительным штаммом. Для сильных антагонистов, таких как лактобактерии, синегнойная палочка и бациллы характерно конститутивное проявление признака, слабо зависимое от тест-культур.

Схожие данные были получены на чувствительных культурах S.aureus, S.hominis, C.minutissimum и E.cloacae. После обработки антагонистов их клеточными компонентами активные штаммы проявляли к ним антагонизм в большей степени по сравнению с контролем. Данную зависимость оказалось возможным выявить «чашечным» способом, в модификации метода Фредерика путем добавления в среду культивирования антагониста компонентов тест-культуры, но частота выявления и выраженность признака были много ниже, по сравнению с разработанным методом.

 Выраженность антагонистической активности бактерий к M. luteus в-0

Рис. 1 - Выраженность антагонистической активности бактерий к M. luteus в зависимости от присутствия его клеточных компонентов в среде культивирования антагониста.

Полученные результаты по зависимости проявления антагонистической активности бактерий от чувствительной культуры позволяют заключить, что антагонизм – результат межмикробных отношений между активной и чувствительной культурами.

Механизм стимулирующего действия тест-культур вероятно связан с индукцией/стимуляцией продукции антимикробных веществ антагонистом. Описаны два типа индукторов антагонизма из чувствительных культур – пептиды индукции бактериоциногении (Barefoot et al., 1994, Maldonado et al., 2004) и клеточные стенки микроорганизмов, стимулирующие синтез литических ферментов у антагонистов в системах «эукариот - эукариот» (Elad, 1996, Haran et al., 1996, Patterson, Boris, 1997) и «эукариот - прокариот» (Ordentlich et al., 1988, Fermor, Wood, 1997, Nelsen et al., 1998, Watanabe et al., 1990, 1999, Fguira et al., 2008).



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.