WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий

-- [ Страница 1 ] --
На правах рукописи

Гоголева Ольга Александровна

КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.02.03 – «Микробиология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург – 2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН

Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Заслуженный работник высшей школы РФ, профессор, зав. кафедрой биологии ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России Соловых Галина Николаевна
Кандидат биологических наук, зав. микробиологии ГБОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России Тимохина Татьяна Харитоновна
Ведущая организация
ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Предполагаемая дата защиты 16 февраля 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии в зале заседаний диссертационного совета по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

Тел.: (3532) 77-59-95; факс: (3532) 77-24-59; e-mail: orgma@esoo.ru), официальный сайт: http://orgma.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « » 2012 г., автореферат и текст объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения – сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И.Ю., 2005; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. 2006; Buckley et al., 1976).

Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и не загрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань А.В., 1989; Бердичевская М.М., 1991; Коронелли Т.В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В., 1995; Куюкина М.С. и др., 1999; Звягинцева И.С. 2001; Плотникова Е.Г., 2001; Сопрунова О.Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).

В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И.В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксигеназ и оксидаз (Готтшалк Г., 1982). Кроме того, в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые протекают по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров А.А., 1984; Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс, спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что приводит с течением времени к гибели клетки (Современная микробиология..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструкции.



Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенности почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.

Цель работы. Определить значение каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Основные задачи:

  1. Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.
  2. Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.
  3. В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.
  4. Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.
  2. Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов – деструкторов.

Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и мезотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных - грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардиоформных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминируют виды Pseudomonas и Alcaligenes.

Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед.). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампозитивных – у Xanthobacter sp.

На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6 до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20 %, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.

На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.

Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2396340 (2010); патент РФ № 2426781 (2011)).

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.

Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляющих бактерий. Штамм Gordona terrae - активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); IX Съезде Гидробиологического Общества при РАН (Тольятти, 2006); 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007); X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009); Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).





Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010); Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010); «Региональном молодежном инновационном конвенте» (г. Оренбург, 2011); золотой медалью Х Московского международного салона инноваций и инвестиций (г. Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы – в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов» (№ 2396340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2426781, 2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель содержит 146 источников литературы, из них 114 отечественных и 32 зарубежных. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 36 рисунками, включая оригинальные микрофотографии.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос. регистрации 01.20.02 16537); Ассоциативный симбиоз водных микроорганизмов и его значение в санитарной и экологической практике (№ гос. регистрации 01201067428); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» (проект № БР-9-040); Госконтракта № 9 (276/06-000874.1) с Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области «Экспериментальное изучение и обоснование использования факторов микробной персистенции в экологической практике».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования. Материалом для исследования послужили углеводородокисляющие бактерии, выделенные из природных водоемов Оренбургской области, штаммы бактерий, выделенные из ассоциации с зеленой водорослью Chlamydomonas reinhardii Dang. (Институт микробиологии РАН, г. Москва), а также дериваты К12 Escherichia coli, различающиеся по наличию гена, кодирующего каталазную активность (штаммы Um 1 (Cat -, Lac-) и CSH 7 (Cat +, Lac-) из коллекции P. Loewen, любезно предоставленные д.б.н. О.Н. Октябрьским (Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь). Были обследованы пойменные озера Беленовское и Рудничное Оренбургского района, Оренбургской области и река Илек на всем ее протяжении.

Пойменные водоемы характеризуются одинаковым происхождением, сходными морфометрическими и гидрохимическими показателями, но различаются интенсивностью антропогенной нагрузки. Озеро Рудничное не вовлечено в хозяйственную деятельность человека, тогда как на берегу озера Беленовское, располагаются два населенных пункта и фермерские хозяйства.

Река Илек испытывает сильную антропогенную нагрузку, воды реки относятся к 4 «а» классу качества. В верховьях Илека находится крупное Актюбинское водохранилище, ниже по течению реки располагаются различные по величине населенные пункты, в том числе г. Актюбинск, и крупные химические производства: Актюбинский завод хромовых соединений, завод ферросплавов, Актюбинская ТЭЦ.

Отбор планктонных проб воды проводили в течение 2004 – 2008 гг. Пробы бактериопланктона обрабатывали стандартно (Кузнецов С.И., Дубинина Г.А., 1989). Чистые культуры бактерий получали бактериологическим методом с использованием элективных сред. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств (Определитель бактерий Берджи..., 1997), а также согласно определителю нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (Weyant R.S. et al., 1996) и руководству Нестеренко с соавт. (1985). Определение типа клеточной стенки проводили в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь, зав. лабораторией член-корр. РАН, д.м.н. Демаков В.А.) стандартными методами (Звягинцев Д.Т., 1991).

Лизоцимную и антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом (Бухарин О.В., 1984). Содержание перекиси водорода при деструкции углеводородов нефти оценивали в реакции хемилюминесценции по методу Хайруллина Р.М., Ахметовой И.Э. (2001) на кафедре фармацевтической и общей химии ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии (г. Оренбург, зав. кафедрой д.м.н., профессор Красиков С.И.). Каталазную активность бактерий определяли качественным и количественным методами (Вейант Р. и др.,1999; Бухарин О.В. и др., 2000). Полноту потребления нефти или нефтепродуктов определяли флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02»в аккредитованной лаборатории испытательного центра ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области», г. Оренбург.

Результаты экспериментальных исследований были подвергнуты статистической обработке с помощью пакета программ Statistika 6,0, а также процессора электронных таблиц “Microsoft Excel 2003” for Windows XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение биологического разнообразия углеводородокисляющих бактерий в озерах Беленовское, Рудничное и в реке Илек проводилось впервые и ограничивалось планктонным сообществом.

При оценке биологического разнообразия и свойств углеводородокисляющих бактерий учитывались следующие характеристики и свойства:



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.