WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов mycobacterium tuberculosis

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шрамко

Павел Александрович

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Специальности: 03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ОБОЛЕНСК-2012

Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Научные руководители: член-корреспондент АМН,

доктор медицинских наук, профессор

Дятлов И. А.

кандидат биологических наук

Потапов В. Д.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Гремякова Татьяна Андреевна

доктор медицинских наук

Ерусланов Борис Васильевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «01» марта 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «___» _____________ 2012 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу:

142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета

Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: fursova@obolensk.org

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Туберкулез продолжает оставаться серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Ежегодно приблизительно 1 млрд. человек контактируют с носителями данной инфекции и подвергаются риску быть инфицированными туберкулезом, 8-10 млн. заболевают, и до 3 млн. человек умирают от туберкулеза. В ряде случаев заболевание и смерть являются результатом реактивации латентных форм туберкулезной инфекции. Реактивация латентного туберкулеза может произойти под воздействием неблагоприятных факторов, таких как хронический стресс, голод и другие состояния, а также заболеваний, приводящих к иммуносупрессивному эффекту, например, СПИД, системные гематологические и онкологические заболевания. Также известны случаи активации туберкулезной инфекции после применения иммунодепрессантов.

Вакцина БЦЖ, применяемая для профилактики туберкулеза во всем мире, может быть небезопасна при действии иммунодепрессирующих факторов. В ряде исследований показано, что заболевание СПИДом может провоцировать активацию вакцинного штамма и приводить даже к смертельному исходу.

Известно, что туберкулезная инфекция может протекать не только в активной форме, но и в латентной, когда возбудитель присутствует в организме в виде дормантных (спящих) форм. В последние годы были накоплены данные о молекулярных процессах перехода микобактерий из дормантных форм в состояние активного размножения, в частности, о роли лизоцимо-подобных белков Rpf микобактерий. В лаборатории молекулярной микобактериологии Национального Центра Здравоохранения ЮАР были получены мутанты штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv, в разной степени утратившие способность к продукции одного или нескольких белков Rpf (Downing et al, 2004). В экспериментах in vitro показано, что белки Rpf связаны с активацией хронической туберкулезной инфекции: выделяясь клетками микобактерий в окружающую среду, они воздействуют на клеточную стенку дормантных форм и вызывают их переход в активное состояние (Kaprelyants et al., 1994, Mukamolova et al., 1998; Kell and Young, 2000, Shleeva et al., 2004).

В настоящий момент представляет интерес изучение показанного in vitro активирующего эффекта белков Rpf на более сложном уровне - в организме теплокровных животных. Поэтому актуальной является задача создания модели туберкулезной инфекции на лабораторных животных, которая позволит охарактеризовать делеционные мутанты туберкулезного микроба по генам rpf, оценить их вирулентность для животных, а также особенность активации вызванной ими хронической инфекции под действием иммунодепрессантов. Представляет интерес также селекция вариантов микобактерий, не способных к активации в условиях иммунодепрессии, поскольку они могут быть использованы для создания рекомбинантных противотуберкулезных вакцин нового поколения.

Цель исследования разработка мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и изучение особенностей течения заболевания, вызванного делеционными мутантами M. tuberculosis по генам rpf, в условиях иммуномодуляции.

Задачи исследования:



  1. Разработать мышиную модель хронической туберкулезной инфекции.
  2. Исследовать вирулентные свойства нокаутных по rpf генам мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv.
  3. Изучить процессы активации туберкулезной инфекции под воздействием веществ, модулирующих иммунный ответ, на мышиной модели.
  4. Разработать методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.
  5. Отобрать мутантные штаммы M. tuberculosis H37Rv, не способные к активации под воздействием иммуномодуляторов, и охарактеризовать их иммунногенные и протективные свойства.

Научная новизна

Исследованы особенности процессов течения туберкулезной инфекции, вызванной мутантными по rpf генам штаммами M. tuberculosis, на мышах с использованием двух моделей заражения: аэрогенной и внутрибрюшинной. Изучена активация туберкулезной инфекции, вызванной этими штаммами, обусловленная действием трех иммуномодуляторов (аминогуанидина, моноклональных анти-ФНО антител и ЛПС Escherichia coli). Обнаружен протективный эффект против туберкулеза после иммунизации мышей клетками мутантного штамма M. tuberculosis H37Rv, лишенного генов rpfA, rpfB, rpfC и rpfD.

Практическая значимость

Создана мышиная внутрибрюшинная модель туберкулезной инфекции, которая позволяет изучать влияние различных факторов на течение хронического туберкулеза. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», 2010 г. Депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМКК-Оболенск мутантный штамм M. tuberculosis H37Rv, лишенный генов rpfA, rpfB, rpfC и rpfD, в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Положения, выносимые на защиту

  1. Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей, приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции.
  2. Мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf, обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом.
  3. Хроническая туберкулезная инфекция, вызванная лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, может быть активирована под действием иммуномодуляторов, чего не наблюдается в случае инфекции, вызванной мутантными штаммами, лишенными трех-четырех генов rpf.
  4. Мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов rpf, обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Личный вклад соискателя

Все эксперименты по низкодозовому аэрозольному заражению мышей, ПЦРидентификация штаммов и измерение уровня ФНО в препаратах органов, выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в планировании экспериментов, разработке внутрибрюшинной модели заражения и в определении вирулентности штаммов микобактерий при этом типе введения возбудителя, совместно с сотрудниками ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и института биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва). Статистическая обработка, анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Апробация работы

Результаты работы представлены на семи международных и российских научных конференциях: научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009; 13ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009; Современные проблемы инфекционной патологии - Минск, 2009; 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010; III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011; 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2011; 12ом международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011.

Диссертация апробирована на межлабораторном научном семинаре ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии – протокол № 18 от 21 ноября 2011 г.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе одна статья в рецензируемом журнале из перечня ВАК и 8 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах. Список цитируемой литературы включает 169 наименований. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и две таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы штаммы возбудителя туберкулеза: М. tuberculosis H37Rv и его нокаутные мутанты по генам rpf (АВ, АС, АВС, АСD, АВСD, АСDE, АВСDE), а также штамм Мycobacterium bovis БЦЖ.





Эксперименты по заражению животных проводили на 6-8 недельных самках мышей линии C57Bl, выращенных изолированно в боксах с фильтрованным воздухом, в условиях, соответствующих уровню биологической безопасности BSL-III. Мышей заражали внутрибрюшинно, инфекционная доза микобактерий варьировала в зависимости от иммуногенности используемых штаммов и способов введения возбудителя и составляла в разных экспериментах от 103 до 105 КОЕ в 0,2 мл суспензии на мышь. Аэрогенное заражение животных проводили по стандартной методике в в аэрозольной камере Inhalation Exposure System 099C A4224 (Glas-Col, США), которая обеспечивала начальную инфицирующую концентрацию в легких от 200 до 400 КОЕ на животное. Эвтаназию мышей осуществляли с помощью CO2.

Гомогенаты органов (легкого или селезенки) животных готовили в буфере PBS, содержащем 0,05 % Твин 80, и высевали на чашки Петри с агаризованной средой Мидлбрука 7H11 (Himedia, Индия) в серии разведений. Для каждого измерения отбирали органы 6 животных. Количество живых бактерий КОЕ определяли после 21 дня инкубации чашек Петри при температуре 37 °C. Результаты учитывали и математически обрабатывали.

Выделение хромосомной ДНК M. tuberculosis проводили из 100 мкл гомогената органа мыши методом Блина и Стафорда с использованием протеиназы К (Blin, Stafford, 1976).

ПЦР-анализ проводили на приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). В качестве матрицы использовали образцы разведений препаратов ДНК, выделенной из гомогенатов органов животных. В качестве мишени использовали последовательность инсерционного элемента IS6110 размером 163 п. о. в хромосомной ДНК  M. tuberculosis. Амплификацию осуществляли в 25 мкл реакционной смеси с использованием пары специфических праймеров: прямого - IS6GGCTGTGGGTAGCAGACC и обратного - IS7CGGGTCCAGATGGCTTGC. Программа амплификации включала в себя: предварительную денатурацию при 95 °С, 5 мин; 32 цикла, включающих денатурацию при 95 °С, 30 с, отжиг при 67 °С, 45 с и элонгацию при 72 °С, 45 с, и завершающую элонгацию при 72 °С, 5 мин. Продукты амплификации (10 мкл) анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле. В качестве положительного контроля использовали ПЦР-продукты, наработанные на ДНК-матрице M. tuberculosis H37Rv. Количество геномов микобактерий в органе животного оценивали визуально по результатам электрофореза, считая последнее, давшее положительный сигнал, разведение проверяемого образца соответствующим 200-250 микобактериям. Далее рассчитывали содержание микобактерий в органе, учитывая фактор разведения.

Определение количества ФНО в сыворотке крови мышей проводили на приборе Victor X3 2030 (Perkin Elmer, Сингапур) с помощью набора реактивов «Mouse TNF- Platinum ELISA» (Bioscience, США), в соответствии с руководством производителя.

Введение иммуномодулирующих веществ в организм животного. Препараты моноклональных анти-ФНО антител, любезно предоставленные к.б.н. Аббасовой С.Г. (Группа иммунохимии Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино), вводили животным внутрибрюшинно в 2 мл физиологического раствора в течение 10 дней. Введение аминогуанидина (Fluka, Германия) осуществляли путем принудительного поения мышей водным раствором (125 мкг аминогуанидина на животное в сутки в течение 10 дней) или путем одноразового внутрибрюшинного введения водного раствора препарата. Препараты ЛПС E. coli, любезно предоставленные к.б.н. Шайфутдиновой Р.З. (лаборатория микробиологии чумы ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), вводили животным в брюшную полость однократно по 1,5 мкг на животное.

Результаты исследования

Создание внутрибрюшинной мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и ее характеристика по сравнению со стандартной аэрозольной мышиной моделью.

Для обоснования возможности создания мышиной модели хронической туберкулезной инфекции путем внутрибрюшинного заражения животных и оптимизации условий экспериментов была проведена серия предварительных опытов с использованием лабораторного штамма M. tuberculosis H37Rv и мышей линии С57Вl. Подобрана заражающая доза (103 KOE на особь), при которой летальность не превышала 20 % и отмечалась только в течение первого месяца после заражения (острая стадия инфекции). Ежемесячные высевы бактерий из органов эвтанизированных животных показали наличие в них микобактерий. Отмечена динамика нарастания титра микобактерий в легких мышей в течение первых 60 дней после заражения и сохранение достигнутого уровня в течение нескольких, до 12, месяцев. Величина достигнутого уровня обсемененности зависела, в основном, от дозы заражения, и находилось в пределах 103-104 КОЕ. Динамика обсемененности селезенок при внутрибрюшинном заражении животных имела обратную картину: максимум отмечался через месяц после заражения, и в дальнейшем снижался до определенного уровня (2,7103 КОЕ) (рис. 1а).

Анализ полученных результатов показывает, что при внутрибрюшинном способе заражения наблюдается проникновение микробов через лимфу в селезенку и далее в легкие. Следует отметить, что лимфоидный путь распространения инфекции характерен и для аэрозольного заражения, только в обратном направлении. Именно этим может быть объяснено наличие возбудителя в селезенке и печени после проникновения его через легкие.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.