WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 || 3 |

Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов mycobacterium tuberculosis

-- [ Страница 2 ] --

Эксперименты по аэрозольному заражению мышей клетками штамма M. tuberculosis H37Rv в той же концентрации показали, что на 30-й день после инфицирования животных микобактерии детектировались преимущественно в легких, с максимумом на 60-й день после заражения (рис. 1б). Количество КОЕ микобактерий в селезенке нарастает медленнее и достигает максимума на 90-й день. К концу четвертого месяца количество КОЕ в исследуемых органах животных, зараженных обоими способами, выходит на плато. Уровень сметности животных, зараженных аэрозольно, был выше и с максимумом в период времени между 30-м и 60-м днями (8 мышей).

 Анализ содержания микобактерий в легких и селезенках мышей в-0

 Анализ содержания микобактерий в легких и селезенках мышей в-1

Рисунок 1 - Анализ содержания микобактерий в легких и селезенках мышей в течение четырех месяцев после заражения штаммом M. tuberculosis H37Rv. Количество животных - 48, доза заражения - 5,3103 КОЕ, а – внутрибрюшинное заражение, б - аэрозольное

Сравнительная характеристика развития туберкулезной инфекции, вызванной штаммом M. tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммуномодуляторов.

В данном разделе описаны эксперименты по изучению вирулентности двойных и тройных rpf-мутантов М. tuberculosis H37Rv для мышей линии С57Вl при заражении их высокими дозами возбудителя. Мутантные штаммы лишены возможности продукции части Rpf-белков, определяющих переход дормантных форм возбудителя туберкулеза в активную форму даже под воздействием факторов, ослабляющих иммунитет. Контрольную группу мышей заражали клетками исходного штамма М. tuberculosis H37Rv. Результаты исследования вирулентности штаммов, несущих делеции двух и трех генов rpf, полученные на двух моделях заражения, представлены на рис. 2.

 Выживаемость мышей при заражении большими (до 106 КОЕ) дозами-2

 Выживаемость мышей при заражении большими (до 106 КОЕ) дозами-3

Рисунок 2 - Выживаемость мышей при заражении большими (до 106 КОЕ) дозами штаммов М. tuberculosis: (а) - внутрибрюшинный и (б) - аэрозольный способы введения возбудителя; АВ, АС, АВС, АСD - двойные и тройные мутанты по rpf генам М. tuberculosis H37Rv

Из приведенного рисунка видно, что, как у исходного штамма, так и у его нокаутных мутантов, наблюдаются некоторые различия в динамике смертности мышей при высокодозовых - аэрогенной и внутрибрюшинной - способах заражения. Но, в целом, штаммы, несущие делеции генов rpf, менее вирулентны. Даже при высокой начальной дозе заражения летальность не превышала 30 %. Аттенуация мутантных штаммов наблюдалась как у двойных, так и (более значительная) у тройных и четверных мутантов. Бактерии с нокаутной мутацией всех пяти rpf генов вызывали хроническую туберкулезную инфекцию у мышей, но при этом находились полностью в дорматном состоянии, они определялись в органах животных методом ПЦР в течение года, но при этом не культивировались на плотных питательных средах.

Для исследования процессов активации туберкулеза представлялось необходимым добиться протекания инфекции в хронической форме. Этого достигали подбором доз возбудителя, введение которых животным приводило к устойчивому (в течение нескольких месяцев) показателю инфицирования, каковым являлось содержание КОЕ в легком для каждого из изучаемых мутантов. Динамика изменения обсемененности легких животных, зараженных микобактериями, несущими делеции четырех генов rpf, представлена на рис. 3.

Рисунок 3 - Сравнительная динамика течения в легких туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом M. tuberculosis  H37Rv и четверными нокаутными мутантами по генам rpf (ABCD и ACDE), доза заражения - 1,3104 КОЕ

Результаты экспериментов, проведенных с двойными и тройными нокаутными мутантами по генам rpf штамма M. tuberculosis H37Rv, показали, что при заражении мышей клетками этих штаммами, инфекционный процесс также протекает в менее острой форме, и показатель КОЕ стабилизируется на уровне на 1-2 порядка ниже, чем при заражении клетками исходного штамма M. tuberculosis H37Rv.

Закономерности развития туберкулезной инфекции у мышей под действием иммуномодуляторов.

Как известно, при исследовании туберкулезной инфекции большое значение уделяется исследованию процессов активации хронического туберкулеза. Для подавления иммунитета мышей мы использовали: (1) аминогуанидин, являющийся одним из блокаторов индуцибильной NOсинтазы; (2) моноклональные антитела к ФНО, блокирующие фактор некроза опухоли; и (3) ЛПС E. coli, вызывающий при высоких концентрациях общее подавление иммунитета. На рис. 4-6 представлены результаты, по активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной штаммом M. tuberculosis H37Rv (исходная доза заражения - 1,3103 КОЕ), полученные с использованием модели внутрибрюшинного заражения мышей. Установлено, что аминогуанидин оказывал активирующее действие на течение туберкулезной инфекции, что ранее было показано другими авторами при аэрозольном способе заражения на модели мышей, зараженных штаммом M. tuberculosis Erdman. В нашем эксперименте уже через месяц после поения животных водным раствором этого иммунодепрессанта количество КОЕ микобактерий в легких мышей возрастает на порядок и продолжает увеличиваться через 60 дней после начала активации. К 90-му дню обсемененность легких микобактериями снижается, и инфекция стабилизируется на новом уровне, превышающем доактивационное значение КОЕ (рис. 4).





Рисунок 4 - Динамика изменения КОЕ в легких хронически больных мышей (шт. M. tuberculosis H37Rv) под влиянием поения аминогуанидином (125 мкг на животное в сутки в течение 10 дней)

Иммуномодуляция анти-ФНО моноклональными антителами хронической туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом M. tuberculosis H37Rv, привела к резкому возрастанию содержания микобактерий в легких мышей через 30 дней после активации. К 90-му дню титр микобактерий, подвергнутых активации, резко снижался, и выходил на доактивационный уровень (рис. 5).

Рисунок 5 - Динамика изменения КОЕ в легких мышей, больных хроническим туберкулезом (шт. M. tuberculosis H37Rv), после внутрибрюшинного введения анти-ФНО моноклональных антител

Рисунок 6 - Динамика изменения КОЕ в легких хронически больных мышей (шт. M. tuberculosis H37Rv) под действием ЛПС E. coli (1,5 мкг в 1 мл физраствора внутрибрюшинно)

Введение в организм зараженных мышей ЛПС E. coli также привело к увеличению показателя КОЕ в легких на порядок уже на 10-й день, в дальнейшем наблюдалось снижение обсемененности, и исчезновение активируюшего эффекта происходило уже к 60-му дню от начала активации, что может быть объяснено быстрым разрушением ЛПС в организмах мышей (рис. 6).

Изучение действия различных иммуномодуляторов на процесс хронической туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными мутантами M. tuberculosis H37Rv по разным rpf генам.

Активация хронической туберкулезной инфекции у мышей, вызванной нокаутными мутантами M. tuberculosis H37Rv, под действием аминогуанидина, анти-ФНО моноклональных антител и ЛПС E. coli показала, что ввеедние иммуномодуляторов в организм испытуемых животных не приводило к изменению течения туберкулезной инфекции у животных, зараженных тройными нокаутными мутантами по rpf генам (рис. 7-9).

 Влияние аминогуанидина на динамику КОЕ в легких мышей, хронически-8 Влияние аминогуанидина на динамику КОЕ в легких мышей, хронически-9

Рисунок 7 - Влияние аминогуанидина на динамику КОЕ в легких мышей, хронически больных туберкулезом, вызванным тройными нокаутными мутантами по генам rpf, а - M. tuberculosis H37Rv ABC, б - M. tuberculosis H37Rv ACD

 Динамика изменения КОЕ в результате активации анти-ФНО-10 Динамика изменения КОЕ в результате активации анти-ФНО-11

Рисунок 8 - Динамика изменения КОЕ в результате активации анти-ФНО моноклональными антителами у хронически больных животных зараженых тройными нокаутными мутантами по генам rpf а - M. tuberculosis H37Rv ABC, б - M. tuberculosis H37Rv ACD

 Динамика изменения КОЕ в результате активации ЛПС E. coli у-12 Динамика изменения КОЕ в результате активации ЛПС E. coli у-13

Рисунок 9 - Динамика изменения КОЕ в результате активации ЛПС E. coli у хронически больных животных зараженых тройными нокаутными мутантами по генам rpf, а - M. tuberculosis H37Rv ABC, б - M. tuberculosis H37Rv ACD

Та же картина наблюдалась и при попытках активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной четверными нокаутными мутантами. Штаммы с делециями двух генов rpf активировались всеми тремя исследуемыми препаратами, но эффект иммуномодуляции проявлялся менее остро, чем при хронической инфекции, вызванной штаммом M. tuberculosis H37Rv.

Изучение течения острого туберкулезного процесса у мышей, иммунизированных штаммами M. tuberculosis H37Rv, нокаутными по разным генам rpf.

Проведено сравнение протективного эффекта штаммов M. tuberculosis H37Rv ABCD и M. bovis БЦЖ для мышей. Животных, иммунизированных названными штаммами аэрозольно, на 30-й день заражали высокой дозой ( 1,5106 КОЕ) вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv. Уровень бактериальной нагрузки в гомогенатах легких подопытных животных учитывали на 10, 30, 60, 90 и 120й дни после вторичного заражения (рис. 10).

Рисунок 10 - Протективный эффект иммунизации мышей клетками штаммов M. tuberculosis ABCD и M. bovis БЦЖ (1,3103 КОЕ), контроль – неиммунизированные мыши

На всем протяжении эксперимента значение показателя КОЕ у неиммунизированных животных на порядок превышало аналогичное значение у иммунизированных мышей. У мышей, иммунизированных вакциной БЦЖ, на 10-й день после повторного инфицирования клетками штамма M. tuberculosis H37Rv обсемененность легких была значительно меньше, чем у мышей, иммунизированных штаммом M. tuberculosis H37Rv ABCD, но к 30му дню обсемененность легких в обеих группах животных сравнялась, и в дальнейшем колебалась на уровне около 1105 КОЕ.

Таким образом, штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов – rpfА, rpfB, rpfС и rpfD, защищал мышей против туберкулезной инфекции, и может быть в дальнейшем использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, разработана и апробирована в эксперименте модель мышиного хронического туберкулеза, вызываемого внутрибрюшинным введением возбудителя туберкулеза. Использование данной модели позволяет изучать влияние различных факторов и веществ на течение хронической туберкулезной инфекции. Кроме того, эта модель может быть использована для сравнения разных штаммов туберкулезного микроба, в том числе – мутантных по разным генам, что позволит получить новые знания о молекулярной организации туберкулезного микроба, а также проводить тестирование новых штаммов, не способных к активации, для отбора кандидатов на создание вакцины нового поколения. В ходе проведенного исследования показана роль генов rpf, в активации латентного туберкулеза. На данной модели подтверждено, что иммуномодуляторы способны влиять на процесс активации хронического туберкулеза.

ВЫВОДЫ

  1. Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей, приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции. Данные, полученные при внутрибрюшинном заражении, дают высокую повторяемость и близки к результатам, полученным при аэрозольном заражении. Внутрибрюшинная модель более удобна в использовании, позволяет работать с большим количеством животных и не требует дорогостоящего оборудования.
  2. Показано, что мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf, обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом. Туберкулезная инфекция, вызванная ими, протекает менее остро и характеризуется более низкими уровнями обсемененности микобактериями внутренних органов мышей.
  3. Показана активация хронической туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, под действием иммуномодуляторов аминогуанидина и анти-ФНО моноклональных антител и ЛПС. Активации инфекции, вызванной мутантными штаммами М. tuberculosis H37Rv, лишенными трех-четырех генов rpf, названными иммуномодуляторами не наблюдалось.
  4. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.
  5. Показано, что мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов – rpfА, rpfB, rpfС и rpfD, обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

а) статьи в реферируемых журналах

  1. Моделирование хронической туберкулезной инфекции у мышей методом внутрибрюшинного заражения и анализ активации аминогуанидином мутантов штамма H37RV с делециями по генам rpf / П.А. Шрамко, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая, В.Д. Потапов, А.С. Капрельянц, С.Ф. Бикетов // Туберкулез и болезней легких, № 4, 2010. – С. 47-50.

б) другие публикации



Pages:     | 1 || 3 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.