WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Роль нейроглиальных взаимодействий и кальциевой сигнальной системы в реакциях нейронов и глиальных клеток речного рака на фотодинамическое воздействие

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Лобанов Андрей Владимирович

РОЛЬ НЕЙРОГЛИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

И КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

В РЕАКЦИЯХ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК РЕЧНОГО РАКА

НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ воздействие

03.00.13 – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2007

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нейрокибернетики им. А.Б. Когана государственного образовательного учреждения

высшего профессионального образования

«Ростовский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Узденский Анатолий Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Менджерицкий Александр Маркович

доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино-на-Оке)

Защита диссертации состоится «7» ноября 2007 г. в _______часов на заседании диссертационного Совета Д. 212. 208. 07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г.Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, ЮФУ, ауд. _______)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ЮФУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан «___» 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Бабенко В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Одна из актуальных проблем современной нейрофизиологии – изучение функций глиальных клеток (ГК) в их взаимодействии с нейронами. ГК обеспечивают нейроны энергией, поддерживают концентрацию ионов и рН в межклеточной среде, регулируют развитие синаптических связей и проведение нервных импульсов, защищают нейроны от окислительного стресса и т.д. Однако полностью функции глии, а также нейроглиальные взаимодействия еще недостаточно изучены (Laming et al, 2000, Никколс и соавт., 2003). Между тем, нейроглиальные взаимодействия особенно важны в критические периоды развития и при повреждении нервной системы. Исследования последних лет показывают, что нейроны и ГК взаимно поддерживают функционирование и выживание друг друга с помощью межклеточных адгезионных контактов и различных молекулярных сигналов. Такими сигнальными молекулами служат нейротрофические факторы и нейромедиаторы (Barres and Barde, 2000; Thippeswamy et al., 2005; Manesh et al., 2006).

Важнейшим повреждающим фактором для клеток нервной системы является окислительный стресс. Он лежит в основе действия ишемии/гипоксии, нейродегенеративных заболеваний, различных физико-химических воздействий и травм (Storz et al., 1999; Chong et al., 2005). Эффективным индуктором окислительного стресса является фотодинамическое (ФД) воздействие. В его основе лежит образование активных форм кислорода (в частности, весьма токсичного синглетного кислорода) при освещении окрашенных клеток в присутствии кислорода. Это вызывает окислительный стресс и клеточную гибель (Dougherty et al., 1998). ФД эффект лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ), применяемой в онкологии, в частности, для разрушения опухолей мозга. При этом могут повреждаться здоровые нейроны и ГК, окружающие опухоль. Но если влияние ФД-воздействия на опухолевую ткань подробно изучено (Dougherty et al., 1998; Dolmans et al., 2003; Oleinik et al., 2002), то реакции неповрежденной нервной ткани на ФД-повреждение и роль в них нейроглиальных взаимодействий практически не исследованы. Между тем, выяснение механизмов устойчивости здоровой нервной ткани к ФД-воздействию помогло бы оптимизировать его режимы при клиническом применении и разработать способы как усиления ФД-повреждения опухолевых клеток, так и защиты здоровых.

В устойчивости нейронов и ГК к фотоокислительному стрессу особую роль играют процессы меж- и внутриклеточной сигнальной трансдукции, которые регулируют процессы функциональной инактивации и смерти нейронов и ГК (Barres and Barde, 2000; Oleinik et al., 2002; Bragin et al., 2003; Uzdensky et al., 2005,). Поэтому изучение клеточно-молекулярных механизмов повреждения и устойчивости нейронов и ГК к фотоокислительному стрессу является важной физиологической задачей.

Цель работы: Изучить реакции нейронов и глиальных клеток на фотоокислительный стресс, генерируемый фотодинамическим воздействием и выяснить роль происходящих при этом нейроглиальных взаимодействий, обеспечиваемых нейротрофическими факторами и поверхностными и межклеточными белками, а также изучить роль Ca2+-зависимых сигнальных белков и влияния импульсной гиперактивности нейронов на процессы фотодинамического повреждения нейронов и глиальных клеток.

Задачи исследования:

  1. Изучить изменения функциональной активности механорецепторных нейронов речного рака, а также процессы смерти нейронов и окружающих глиальных клеток под влиянием фотодинамического воздействия.
  2. Изучить роль межклеточных и поверхностных белков-мишеней протеолитических ферментов, обеспечивающих нейроглиальные взаимодействия, нейротрофических факторов (NGF, GDNF и HRG1-1), а также Ca2+-зависимых сигнальных белков (кальмодулина и кальмодулин-зависимой киназы II, фосфатидилинозитол- и фосфатидитхолин-специфических изоформ фосфолипазы С, Са2+-АТФаз ЭПР) в регуляции устойчивости нейронов и глиальных клеток к фотоиндуцированному некрозу.
  3. Изучить участие данных сигнальных путей в регуляции устойчивости глиальных клеток к фотоиндуцированному апоптозу.
  4. Изучить влияние этих межклеточных и внутриклеточных сигнальных механизмов на фотоиндуцированное прекращения импульсной активности механорецепторного нейрона.

Научная новизна результатов исследования.



  1. Впервые установлена важная роль процессов меж- и внутриклеточной сигнализации в выживаемости нейронов и глии рецептора растяжения рака при фотоокислительном стрессе. Показано, что эти сигнальные механизмы различаются в нейронах и глиальных клетках, а также неодинаковы при фотоокислительном стрессе и смерти клеток при аксотомии и изоляции.
  2. Впервые обнаружено влияние нейротрофических факторов на нейроны и ГК ракообразных как в темноте, так и при ФД-воздействии. Продемонстрирована модуляция импульсной активности нейронов нейрегулином HRG1-1 и влияние GDNF и NGF на устойчивость ГК к апоптозу, вызванному аксотомией или фотоокислительным стрессом.
  3. Выявлено участие фосфолипазы С и внеклеточных белков-мишеней протеиназ в фотоиндуцированном апоптозе глиальных клеток. Обнаружено, что уровень импульсной активности нейронов влияет на устойчивость сателлитных ГК к проапоптозному действию фотоокислительного стресса.
  4. Впервые показано, что фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа II участвуют в ФД-индуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток.
  5. Показано влияние нейротрофического фактора NGF на фотоиндуцированный некроз глиальных клеток. Таким образом, продемонстрировано, что в процессах фотоиндуцированного некроза клеток механорецептора рака участвуют Са2+-зависимые сигнальные белки. Установлено, что в ФД-индуцированном торможении импульсной активности механорецепторного нейрона участвуют белки межклеточного матрикса и фосфолипаза С.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные данные о фотодинамическом повреждении нейронов и глиальных клеток могут быть использованы при разработке и оптимизации способов фотодинамической терапии опухолей мозга. Данные о фармакологической модуляции сигнальных процессов могут применяться для разработки методов повышения селективности ФД-воздействия в нейроонкологии и экспериментальной нейробиологии, позволяющих усилить фотоиндуцированную смерть перерожденных клеток и защитить нормальные нейроны и ГК. Результаты работы использованы при выполнении исследований по грантам РФФИ № 02-04-48027 и 05-04-48440, а также в учебном процессе в спецкурсах по фотобиологии и фотомедицине, читаемых на кафедре биофизики и биокибернетики ЮФУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Реакция нейронов и ГК механорецептора рака на фотодинамическое воздействие регулируется процессами меж- и внутриклеточной сигнализации, различающимися в нейронах и глиальных клетках. Фармакологическая модуляция сигнальных процессов может усиливать повреждение клеток или защищать их от фотоокислительного стресса.
  2. В обеспечении устойчивости глиальных клеток рецептора растяжения рака к проапоптозному действию фотоокислительного стресса участвуют межклеточные и поверхностные белки-мишени протеиназ, нейротрофические факторы, фосфолипаза С и импульсная активность нейрона.
  3. Фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа II снижают устойчивость нейронов и глиальных клеток к некрозу, вызванному фотоокислительным стрессом, а NGF ее повышает.
  4. В процессе функциональной инактивации механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии участвуют белки внеклеточного матрикса и фосфолипаза С, а также нейрегулин HRG1-1.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации представлены на всероссийских и международных конференциях: «IV съезд фотобиологов России» (Саратов, 2005), «Биология – наука XXI века». 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2005), «11th Congress of the European Society for Photobiology» (Aix-Les-Bains, France 2005), «I съезд Физиологов СНГ» (Сочи, 2005), Колосовские чтения, (СпБ, 2006); 2-й Международный Междисциплинарный Конгресс, (Судак, Украина, 2006), «Glia in health and disease» (Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 2006), «Simpler Nervous Systems» (Казань, 2006), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2007), «12th Congress European Society for photobiology» (London, England, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ. Личный вклад автора в опубликованном материале в среднем 50%, объем 2,5 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 272 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 51 рисунком и 11 таблицами.





МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на рецепторе растяжения рака (РРР) Astacus leptodactilus (Рис.1, А2), состоящем из рецепторной мышцы (Рис.1, Б1), на которой находятся механорецепторный нейрон (МРН) (Рис.1, Б2) с отходящим от него аксоном (Рис.1, Б3), и сателлитной глиальной оболочкой вокруг него (Рис.1, Б4). Общая схема опытов изображена на Рис.1

Изолированный МРН генерирует потенциалы действия (ПД) (Рис.1, Г4) 10-12 часов, частота ПД напрямую зависит от степени растяжения рецепторной мышцы. После изоляции РРР закрепляли в кювете с физиологическим раствором Ван-Харревельда (Рис.1, В1).

ПД отводили внеклеточно с помощью присасывающегося к аксону стеклянного электрода (Рис.1, В5), усиливали усилителем УУ-90 (Рис.1, Г1) и непрерывно регистрировали их частоту. По частотограмме (Рис.1, Г3) определяли время жизни МРН от начала облучения до прекращения ПД.

Рис. 1. Схема эксперимента по изучению ФД-воздействия на МРН и ГК

Рак: А1 – брюшная нервная цепочка, А2 – РРР, А3 – вырезаемые кусочки панциря, на которых крепится РРР. Препарат: Б1 – механорецепторная мышца, Б2 – МРН, Б3 – аксон, Б4 – оболочка из сателлитных ГК. Установка: В1 – кювета, В2 – опытный РРР, В3 – контрольный РРР, В4 – регулятор растяжения рецепторной мышцы, В5 – присасывающиеся электроды, В6 – добавление фотосенсибилизатора или модификатора, В7 – лазер. Биопотенциалы: Г1 – усилитель, Г2 – импульсная активность опытного МРН, Г3 – частотограмма опытного МРН, Г4 – импульсная активность контрольного МРН, Г5 – частотограмма контрольного МРН.

Частота генерации импульсов контролировалась адекватно путем растяжения рецепторной мышцы (Рис.1, В4). Для исследования влияния гиперактивности МРН на реакцию клеток на ФД-воздействие стимуляция осуществлялась путем неоднократного (до 10 раз) растяжения рецепторной мышцы, не допуская уменьшения частоты ПД ниже 10-15 Гц. После 1 часа активного функционирования МРН подвергали ФД-воздействию.

В каждую серию опытов входили: контроль, воздействие исследуемого модификатора, ФД-воздействие, сочетанное действие ФД-воздействия и модификатора. При ФД-воздействии после 20-30 минутной регистрации ПД в ванночку добавляли сенсибилизатор Фотосенс (Рис.1, В6) (смесь ди-, три- и тетра-алюмофталоцианинов, НИОПИК, Москва) в концентрации 10-7 М, инкубировали 30 мин и облучали 30 мин He-Ne лазером (ЛГН-111, 632,8 нм; 0,3 Вт/см2) (Рис.1, В7).

Во всех сериях препараты инкубировались 7-8 часов (Uzdensky et al., 2005). После инкубации препараты флуорохромировались пропидиум иодидом и Hoechst-33342, промывались, фиксировались глутаральдегидом, заключались в глицерин и изучались на флюоресцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3 (ЛОМО, Ленинград) с цифровой камерой Nikon Coolpix 995.

Пропидиум йодид, проникая в клетки с поврежденной плазматической мембраной, окрашивает ядра в красный цвет. Т.к. повреждение мембраны характерны для некроза, по красной окраске определялся этот тип смерти клеток. Hoechst-33342 придает хроматину сине-зеленую флуоресценцию, позволяя определить общее число клеток. На микрофотографиях определялось число ГК на единицу площади, процент некротических МРН и ГК, а также количество апоптозных ГК с фрагментированными ядрами, окружающих аксон (на протяжении 2 мм его длины).

Для исследования роли нейроглиальных взаимодействий в реакциях нейронов и ГК на ФД-воздействие в одной серии опытов РРР обрабатывали в течение 1 часа протеолитическими ферментами проназой (0,01%) и коллагеназой (0,02%), после чего препарат промывался и подвергался ФД-воздействие. В другой серии опытов в кювету с РРР за полчаса до облучения добавлялись нейротрофические факторы (НТФ) NGF (100 нг/мл), GDNF (10 нг/мл) и нейрегулин HRG1-1 (10 нг/мл).

Для исследования роли фосфатидилхолин-специфичной фосфолипазы С (ФХ-ФЛС) использовался ингибитор D609 (7,5 мкМ), фосфатидилинозитол- специфичной фосфолипазы С (ФИ-ФЛС) – ЕТ-18 (20 мкМ), кальциевых АТФ-аз эндоплазматического ретикулума (ЭПР) – тапсигаргин (1 мкМ), кальмодулина (КМ) – флюфеназин (1 мкМ), кальмодулин-зависимой киназы II (КМК II) – KN-93 (2 мкМ). Эти вещества добавлялись за 15-30 мин до ФД-воздействия. Концентрации модификаторов были подобраны так, чтобы не вызывать инактивацию нейронов в темноте в течение нескольких часов. Контролем служили препараты, подвергшиеся только ФД-воздействию.

Статистический анализ результатов экспериментов проводился по t-критерию Стьюдента (Владимирский, 1983). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка.

Результаты исследования

Глиальные клетки

Сигнальные механизмы, регулирующие устойчивость ГК к апоптозу

Аксотомия и изоляция (АИ) после вырезания РРР способствовали апоптозу некоторых глиальных клеток. ФД-воздействие значительно усиливало этот процесс. В то же время, апоптоз МРН не наблюдался ни при ФД, ни при фармакологических воздействиях. На устойчивость ГК к апоптозу, вызванному изоляцией или фотосенсибилизацией, могут влиять нейроглиальные взаимодействия (Barres and Barde, 2000; Laming et al, 2000; Никколс и др., 2003). Они реализуются, в частности, с помощью поверхностных и межклеточных белков, сигнальных нейротрофических факторов и биоэнергетических процессов. Для изучения роли нейроглиальных взаимодействий в реакциях нейронов и глии на фотоповреждение в настоящей работе использовались протеолитические ферменты, нарушающие связи между этими клетками, НТФ, предположительно осуществляющие нейроглиальные взаимодействия, а также изучалось влияние интенсивного функционирования МРН, при котором быстро расходуются энергетические ресурсы.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.