WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АБАСОВА МИЯСАТ МАГОМЕДРАСУЛОВНА

АКТИВНОСТЬ НЕЙТРАЛЬНЫХ ПРОТЕАЗ

В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ЗИМНЕЙ СПЯЧКЕ И ГИПОТЕРМИИ

03.00.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена на кафедре биохимии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет».

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Нурмагомедова Паризат Мусалаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, гл.н.с.

Друккер Нина Александровна

доктор биологических наук, профессор

Волжина Надежда Григорьевна

Ведущая организация: Ростовский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «17» ноября 2009 г. в 10.00 час. на заседании диссертационного совета Д.212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, ауд. 203).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «___»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.С. Колмакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что у гипотермированных животных, как и скорость метаболизма снижается по мере понижения температуры тела (Kataoka, Yanase, 1998). Наиболее уникальной среди различных типов гипотермии является зимняя спячка (Эмирбеков, Львова, 1985), в частности, в связи с тем, что температурный диапазон активности биохимических реакций зимоспящих животных более широкий (от 0 до 38°С) относительно гомойотермных (Эмирбеков, Львова, 1985; Storey, Storey, 2000; Geiser, 2004). Изменения, вызываемые гипотермией, обнаруживаются во всех органах, которые при этом по-разному реагируют на глубину и скорость охлаждения (Бернштейн, 1971; Рыжакова, 1997).

В отличие от гибернантов, у гомойотермных организмов при гипотермии угнетение процессов синтеза АТФ влечет за собой дефицит энергии, что замедляет транспорт Са2+ из цитозоля в среду и нарушает метаболизм клетки (Hochachka, Somero, 2002). Даже незначительное (с 10-8 М в норме до 10-6 М) повышение содержания Са2+ в цитозоле приводит к активации различных протеолитических и липолитических ферментов в клетке, вследствие чего начинают разрушаться клеточные мембраны (Иванов и др., 1999). Поэтому истощение энергетического субстрата в клетке гомойотермных организмов часто влечет за собой гибель.

Тем не менее, изучение эффектов гипотермии на функциональное состояние гомойотермных организмов является актуальным, т.к. позволяет изучить функциональные основы регуляции жизнедеятельности. Так, рядом авторов доказана положительная роль гипобиоза в лечении сепсиса, вирусных заболеваний, в невосприимчивости к смертельным дозам бактериальных и химических ядов, а также ионизирующего излучения, сохранении жизни тяжелообожженным, а также пострадавшим с обширными размозжениями и сдавлениями тканей, в возможности проведения операции в самых опасных зонах, например, в глубинах мозга, на многих органах и тканях одновременно, лечении опухолей. В настоящее время искусственная гипотермия с охлаждением тела до 20-24°С уже находит применение в хирургии при операциях на сердце и центральной нервной системы. Она значительно снижает обмен веществ в головном мозге, и, следовательно, уменьшает потребность органов и тканей в кислороде. Поэтому мозг в таких условиях способен переносить более длительное обескровливание (до 15-20 мин при 25-28°С) (Sakurai et al., 2005).

Проблема адаптации животных и человека к низким температурам является актуальной также и в связи с все большим проникновением человека в полярные районы Земли и освоением природных ресурсов Севера и Сибири (Мешалкин, Верещагин, 1985).

Коренным отличием зимоспящих от незимоспящих животных является появление «фактора спячки» у зимоспящих в период спячки или непосредственно перед ней. Этот «фактор» выделен и уже применен в эксперименте: незимоспящие после введения этого «фактора» становились «зимоспящими» и переносили без каких-либо последствий такие нагрузки (например, длительное и глубокое охлаждение), которые в 100% случаев в обычном состоянии оканчивались гибелью животных. Поскольку данное вещество, очевидно, белковой природы, актуальным является исследование изменения активности протеолитических ферментов в разных тканях гомойотермных и гетеротермных животных, подвергнутых глубокой гипотермии, а также сопоставление активности этих ферментов с другими биохимическими показателями, включающимися в адаптацию к низким температурам.



В связи с этим, целью данной работы явилось сравнительное исследование активности нейтральных протеаз в тканях гомойо- и гетеротермных животных в динамике зимней спячки, последующего самосогревания после индуцированного пробуждения и гипотермии.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

  1. Исследовать автолитическую активность в мозге, сердце и сыворотке крови сусликов в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении, а также автолитическую активность у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.
  2. Изучить состояние аминокислотных медиаторных систем в мозгу и крови в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.
  3. Исследовать активность глицилглицин-дипептидазы мозга в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.
  4. Исследовать активность Са2+–зависимых нейтральных протеаз тканей в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.
  5. Исследовать общую активность нейтральных протеаз тканей в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Циклические изменения активности протеолитических ферментов в мозгу и сердце сусликов в период подготовки к зимней спячке являются одним из факторов, влияющих на перестройку метаболических процессов с Са2+–зависимых на независимые от уровня Са2+. Двум пикам повышения активности Са2+–зависимых нейтральных протеаз (в сентябре и ноябре) соответствует увеличение активности глицилглициновой-дипептидазы и снижение содержания аминокислотных медиаторов в коре больших полушарий и, особенно, в стволовых структурах мозга гетеротермных животных.
  2. Температурная зависимость автолитической активности тканеспецифична: при повышении температуры тела увеличивается активность автолитических ферментов относительно 2-го месяца спячки сначала в сыворотке крови (10С), а затем в коре больших полушарий (20С), стволовых структурах мозга (25С) и сердце (30С). Активность нейтральных протеаз начинает повышаться в тканях сусликов при менее высоких температурах по сравнению с автолитической активностью.
  3. В условиях принудительной гипотермии в тканях крыс и сусликов происходит понижение активности протеолитических ферментов и содержания ГАМК и глутамата в мозгу. Пролонгирование гипотермии способствует разнонаправленной перестройке метаболизма в тканях сусликов и крыс: у сусликов снижается значимость Са2+–зависимых процессов, тогда как у крыс, напротив, возрастает. После самопроизвольного самосогревания уровень медиаторов в структурах мозга сусликов соответствует контролю, а у крыс наблюдается истощение ГАМК и глутамата.

Научная новизна.

Впервые установлено, что перед впадением в зимнюю спячку у сусликов происходят циклические изменения протеолитической активности ферментов и содержания ГАМК и глутамата в тканях, что является одним из преадаптационных механизмов гибернации.

Впервые показано, что в период зимней спячки в мозгу и сердце сусликов перестройка метаболизма идет путем снижения значимости Са2+–зависимых процессов на процессы независимые от уровня Са2+.

Впервые установлена последовательность активации протеолитических ферментов в разных тканях гетеротермных животных на этапах самосогревания после индуцированного пробуждения.

Впервые показано, что пролонгирование глубокой гипотермии в течение 2-х часов способствует повышению активности протеолитических ферментов в тканях гомойотермных и гетеротермных животных до уровня умеренной гипотермии.

Теоретическая и практическая значимость. Изучение метаболизма при искусственном и естественном охлаждении организма в сравнительном аспекте может приблизить к пониманию общих механизмов резистентности гомойотермных животных к низкой температуре тела, а также имеет значение для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения. Решение указанных теоретических проблем имеет практическое значение при использовании метода гипотермии в медицинской практике.

Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении курса «Энзимология», спецкурса «Кинетика ферментативных реакций», в учебном процессе и на практических занятиях студентов по биохимии Дагестанского государственного университета и филиала ЮФУ в г.Махачкале, в научно-исследовательских работах.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), X Республиканской научно-практической конференции (Махачкала, 2005), Международной научной конференции (Махачкала, 2006), 10-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006), V-й Международной научно-практической конференции (Тамбов, 2007), совместном заседании кафедры биохимии и биофизики с НИИ биологии ДГУ (3 февраля 2009, протокол №7), заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного Федерального университета (21 марта 2009).





Публикации. По данной диссертационной работе опубликовано 7 печатных работ, в том числе в журналах рекомендуемых ВАК РФ – 2 статьи, объемом 0.63 п.л., личный вклад 45%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 218 источников, из них 88 отечественных и 130 иностранных авторов. Работа содержит 20 таблиц и 26 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 85 малых сусликах (Citellus pigmaeus Pallas) массой 200-250 г, являющихся типичными представителями зимоспящих животных (Калабухов, 1985), и 40 белых беспородных крысах – самцах, весом 180-200 г. Сусликов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан) и до наступления холодов содержали в условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Крыс содержали в условиях вивария при температуре +18 - +20°С на стандартном рационе питания. Для избегания сезонных колебаний метаболизма и регуляции функций, опыты проводили в зимние месяцы: декабрь – февраль (Егулова и соавт., 1977, Тендитная, 1977).

Показатели сусликов исследовали в следующие периоды зимней спячки и на следующих этапах самосогревания:

1. Бодрствующие, в июле-августе (нормотермия 38°С); 2. Бодрствующие, в сентябре (нормотермия 38°С); 3. Перед спячкой, начало октября (tт°=16-19°С); 4. Начало спячки, ноябрь (tт°=10-13°С); 5. Через 2 месяца спячки (tт°=3-4°С); 6. Через 3 месяца спячки, начало февраля (tт°=4-5°С); 7. Перед пробуждением, март (tт°=6-7°С); 8. Самосогревание до 10°С, 20°С, 25°С, 30°С и 38°С.

Показатели сусликов и крыс исследовали, подвергая животных искусственной гипотермии в следующих вариантах эксперимента:

1. Нормотермия (контроль); 2. Глубокая гипотермия 20-19°С; 3. Гипотермия 30-33°С; 4. Пролонгирование гипотермии (20°С) в течение 2 часов; 5. Нормотермия после самосогревания.

Контрольную группу составляли животные, содержащиеся в условиях вивария и не подвергшиеся охлаждению. Животных декапитировали, извлекали мозг (кору больших полушарий (кора БП) и стволовые структуры (СтС)), сердце и кровь.

Условия гибернации. Сусликов отлавливали весной – летом методом залива нор. После снижения температуры воздуха до +8-6С животные укладывались в стеклянные баллоны с подготовленной подстилкой. Ежедневно проверяли активность животных методом «опилочной пробы», т.е. при засыпании покрывали их сверху опилками и судили об их активности по тому, стряхнуты они или нет. В торпидном состоянии сусликов исследовали в середине баута (на 3-4 сутки после очередного вхождения в баут спячки). Для изучения процессов, происходящих в ходе пробуждения сусликов, животных через два месяца после начала гибернации, в середине баута спячки помещали в холодильник для достижения температуры тела 2,5С. После этого их переносили в помещение с температурой 25С для самосогревания. Для экспериментов брали сусликов по достижении температуры тела 10, 20, 25, 30 и 38С. Температуру тела животных измеряли в прямой кишке через каждые 10-15 мин. Исследовали также группу сусликов, не спавших зимой, а содержащихся в условиях вивария на полном рационе и в отапливаемом помещении.

Условия искусственной гипотермии. Гипотермию проводили в холодовой камере, в «рубашке» которой циркулировала вода, охлажденная до 8°С. Температура тела животного достигала 33-30°С через 15-20 минут, а 20-19°С - через 50-60 минут, и эта температура поддерживалась в течение двух часов. Температуру тела животных измеряли ректально ртутным термометром.

Методы биохимического анализа. Нейромедиаторные аминокислоты, ГАМК и глутамат в сыворотке крови и отделах мозга определяли методом низковольтного электрофореза на бумаге (Tapia, 1983). Автолитическую активность (АА) и Са2+-зависимую активность нейтральных протеаз (Са2+-ЗНП) определяли по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986). Активность глицилглицин-дипептидазы (ГГД) в мозге животных определяли нингидриновым методом Li и Takakhashi с модификациями (Рева и др., 1982). Общую активность нейтральных протеаз (ОАНП) определяли модифицированным методом Lowry (Алейникова, Рубцова, 1988).

Полученные данные подвергнуты вариационно-статистической обработке по методу малой выборки (Кокунин, 1975). Для оценки статистических различий использовали t-критерий Стьюдента. При Р0,05 различия оценивались как достоверные.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Автолитическая активность в тканях сусликов в динамике зимней спячки и при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. Гибернация сопровождается экстремальными изменениями физиолого-биохимических параметров организма. Температура тела, уровень метаболизма, сердечный ритм и другие параметры деятельности организма падают во время зимней спячки до уровня, который может быть летальным для гомойотермов, но не для гибернантов. Восстановление функций до нормального уровня происходит во время пробуждения со скоростью, которая может затрагивать клеточные и системные регуляторные пути, типичные для негибернантов (Carey et al., 2000; Terleky, Dice, 1993). В связи с этим, результаты, полученные на зимоспящих, могут быть использованы и для выяснения механизмов терморегуляции у гомойотермных организмов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.