WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЗАРИН КИРИЛЛ ВИТАЛЬЕВИЧ

эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса

03.00.16 – экология

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ Биологии Южного федерального университета

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент Усатов Александр Вячеславович; кандидат биологических наук, ст. научн. сотр. Чистяков Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичович доктор биологических наук, доцент Минкина Татьяна Михайловна
Ведущая организация: Кубанский государственный университет, г. Краснодар

Защита состоится “20” ноября 2009 г. в 1700 часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: denisova777@inbox.ru, факс: (863)2638723).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148) и на сайте Южного федерального университета: http://www.sfedu.ru

Автореферат разослан «19» октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Т.В. Денисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность темы. Загрязнение воды, воздуха, выпадение кислотных осадков, деградация почвы, увеличение интенсивности потока ультрафиолетовой радиации и как следствие общее нарушение экологического равновесия привели к тому, что живые организмы все в большей мере подвергаются прессингу широкого спектра экстремальных факторов среды. Исходя из вышеуказанного ясно, что помимо вопросов коррекции состояния окружающей среды, актуальной становиться и проблема повышения устойчивости организмов к этим экологическим факторам. Прикладная, на первый взгляд, проблема поиска методов защиты имеет и фундаментальный аспект. Более глубокое понимание механизмов толерантности к внешним воздействиям, характерных для организмов и экосистем, необходимо для прогнозирования последствий и их предупреждения, что особенно важно в связи с проблемой возможного увеличения генетического груза в условиях нарастающего антропогенного прессинга на природные популяции.

Общим следствием влияния большинства абиотических факторов (Polle and Rennenberg, 1993), в том числе таких широко распространенных как тяжелые металлы (Flora et al., 2008; Liu et al., 2009) и ультрафиолетовое излучение (Kovacs et al., 2009), на организмы является увеличение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК). Поэтому, одна из возможных мер, снижения негативного действия этих факторов на организмы, может быть реализована через систему природных антиоксидантов, уменьшающих внутриклеточные концентрации АФК.

Одними из таких антиоксидантов со свойствами экологических протекторов могут быть продукты деградации пуринов, в частности, аллантоин и мочевая кислота. Так, в серии опубликованных ранее работ (Ames et al., 1981; Гуськов и др., 2002; 2004), сообщалось об обнаружении способности аллантоина и урата подавлять развитие деструктивных процессов, индуцируемых активными формами кислорода. Так же была показана способность аллантоина снижать уровень аберраций хромосом (Гуськов, 2004), что немаловажно для обеспечения защиты от воздействия экстремальных факторов, зачастую обладающих мутагенным эффектом. Активные формы кислорода могут также либо непосредственно индуцировать мутации, либо изменять чувствительность клеток к другим мутагенам (Guetens et al., 2002). Способность урата защищать нуклеиновые кислоты широко применяется на практике, это вещество входит в состав пропитки наиболее популярного «инструмента» консервации ДНК – FTА-карт.

Цель и задачи исследования. Целью работы является эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать действие тяжелых металлов на растения подсолнечника и горчицы и определить уровень устойчивости к этому воздействию в присутствии природных антиоксидантов аллантоина и мочевой кислоты.
  2. Исследовать влияние аллантоина и урата на действие окислительного стресса, индуцированного гипербарической оксигенацией (ГБО), на подсолнечник Helianthus annuus L. и горчицу Brassica juncea Czern.
  3. Изучить при помощи бактериальных биосенсоров действие длинноволнового спектра ультрафиолета (300-400 нм), характерного для солнечного света у земной поверхности, и определить наиболее эффективные концентрации аллантоина и мочевой кислоты, супрессирующие его мутагенный эффект.
  4. Исследовать антимутагенную и супероксидустраняющую активности аллантоина и мочевой кислоты с помощью бактериальных биосенсоров и опытов in vitro.
  5. Провести сравнительный анализ влияния тяжелых металлов и протекторных свойств аллантоина и мочевой кислоты на внеядерные мутанты подсолнечника.

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ устойчивости растений к воздействию тяжёлых металлов в присутствии природных антиоксидантов – аллантоина и урата. Исследовано воздействие ультрафиолета с длиной волны 300-400 нм на бактериальной модели и определена зависимость величины антимутагенной активности аллантоина от его концентрации. Предложена экспериментально обоснованная модель протекторных свойств аллантоина и урата от рассмотренных экологических факторов. Впервые исследовано влияние ядра и цитоплазматических генов на устойчивость растений подсолнечника Helianthus annuus L. к действию тяжелых металлов.



Практическая значимость работы. Полученные результаты позволят расширить и систематизировать современные представления о влиянии таких абиотических факторов как тяжелые металлы и ультрафиолетовое излучение. Выявленный фотопротекторный эффект аллантоина может быть использован для повышения эффективности солнцезащитных смесей.

Информация о повышении устойчивости растений к действию тяжёлых металлов в присутствии аллантоина и урата может быть использована в биотехнологическом процессе получения новых форм – аккумуляторов тяжелых металлов для фиторемедиации загрязненных почв.

Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета Южного федерального университета по специальным курсам кафедры генетики и могут быть использованы в учебном процессе в других вузах.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Пуриновые катаболиты – урат и аллантоин являются эффективными протекторами от действия тяжелых металлов на растения.
  • Аллантоин подавляет мутагенный эффект ультрафиолета с длиной волны 300-400 нм.
  • Аллантоин и урат снижают негативное действие окислительного стресса на растения.
  • Внеядерные мутации подсолнечника приводят к повышению устойчивости растений к действию тяжелых металлов.

Апробация работы. Результаты исследования и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Международной конференции «International interdisciplinary workshop and scientific discussion club IW+SDC’06» (Bangkok – Pattaya, Thailand, 2006); Международной научно-практической конференция «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 2007); III Международной научно-практической конференции «Урбоэкосистемы. Проблемы и перспективы развития» (Ишим, 2008); Международном научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008); IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Крым, 2008); XV Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008); Международной научно-практической конференции «Современная экология - наука XXI века». (Рязань, 2008); II Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (СПб., 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); II-м Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008); II всероссийском с международным участием конгрессе «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 18 работ, объёмом 2,9 п.л., из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК, получен один патент. Доля участия автора в публикациях составляет 80% (2,3 п.л.).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 131 странице, содержит 17 рисунков и 33 таблицы. Список цитируемой литературы включает 169 источника, из них 146 на иностранных языках.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (гранты «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» № 2.1.1/5628 и № 2.1.1/4947).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В сериях лабораторных экспериментов по оценке устойчивости организмов, в присутствие аллантоина и урата, к воздействию солей тяжёлых металлов (Cd++, Pb++, Fe++ и Cu++) использовали семена растений горчицы Brassica junceae Czern и подсолнечника Helianthus annuus L. Инбредная линия 3629 подсолнечника Helianthus annuus L была выведена А.И. Гундаевым в 1959 г. из среднеспелой высокомасличной популяции ВНИИМК 20044. Семена сортовых растений горчицы Лера получена от автора сорта В.Г. Картамышева (Донская опытная станция масличных культур им. Л.А. Жданова, ВНИИМК). Семена проращивали в водных растворах солей тяжелых металлов, аллантоина и урата в различных концентрациях. Каждый опыт проводили в трёх независимых повторах, по 40 семян в каждом из повторов. Степень действия тяжёлых металлов и протекторные свойства антиоксидантов оценивали по степени подавления корневого роста и выживаемости растений через 72 ч прорастания семян.





Для исследования влияния ядра и цитоплазматических генов на устойчивость растений к действию тяжелых металлов из коллекционного материала хлорофилльных мутантов подсолнечника НИИ биологии ЮФУ были отобраны следующие линии: исходная инбредная линия 3629, полученные на её основе хлорофильные пластомныйе мутанты en:clorina-3, en:clorina-5, en:clorina-7 и зеленый ревертант r-en:clorina-7 с изменённой структурой митохондриальной ДНК (Разорителева и др., 1995; Triboush et al., 1999; Усатов и др., 2004).

Антимутагенную активность исследованных соединений in vivo оценивали по способности подавлять индуцированный ультрафиолетом и перекисью водорода SOS-ответ клеток E.coli. В качестве системы для оценки воздействия был применен вариант SOS-lux теста (Сазыкина и др., 2002). Измерения интенсивности биолюминесценции культур проводили на люминометре ЛТ-01.

Культуры E.coli облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 300-400 нм на специальной установке, использующей в качестве излучателя ртутную лампу низкого давления (HG-125). Культуры облучали сублетальной дозой 390 Дж/м2, инкубировали при 25оС в течение 120 минут для развития SOS-ответа. Растворы исследуемых протекторов в дистиллированной воде добавляли до необходимой конечной концентрации за 30 мин до облучения. Оптимальность данного режима обработки обоснована в публикации (Чистяков и др., 2009).

Окислительный стресс моделировали гипербарической оксигенацией (ГБО) в режиме 0,7 МПа чистого кислорода в течение первых 10 ч прорастания семян растений сразу после замачивания. Обработанные и контрольные проростки высевали в поле в оптимальные сроки по типу селекционного питомника на 10-метровых делянках с площадью питания 40-60 см. В качестве критерия устойчивости в полевых опытах определяли всхожесть проростков и высоту растений горчицы и подсолнечника на стадии 3 – 4-й пары листьев.

Хемилюминесцентный анализ проводили на приборе AutoLumat Plus LB 953 фирмы Berthold Technologies в системе H2O2-люминол (5-амино-2,3дигидрофталазидион-1,4). Динамику метаболических изменений оценивали по интенсивности быстрой вспышки и светосуммы хемилюминесценции.

Для определения способности аллантоина и мочевой кислоты подавлять генерацию О2­ использовали разработанную ранее методику (Чистяков и др., 2005). Данные по супероксидустраняющей активности представляли в виде единиц активности супероксиддисмутазы, рассчитанных согласно Фридовичу (Imlay, Fridovich, 1991).

В таблицах представлены средние арифметические и их стандартные ошибки. Каждый опыт проводили в трёх независимых повторах. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Протекторный эффект аллантоина и мочевой кислоты при действии тяжелых металлов на прорастающие семена растений.

В результате проведенных нами исследований было установлено, что исследуемые азотистые катаболиты в концентрациях 10-3 и 10-4 М не оказывают значительного влияния на скорость роста корешков горчицы.

Исследование длины корешков и всхожести семян горчицы под воздействием тяжелых металлов и в присутствие природных антиоксидантов аллантоина и мочевой кислоты, показало достоверное снижение негативного действия тяжёлых металлов. Так проращивание семян горчицы в присутствие соли меди в концентрации 50 мкМ и аллантоина в концентрации 10-3 М увеличивает длину корешка с 37% от контроля (в присутствие только сульфата меди) до 86% относительно контроля. Более того, внесение урата в концентрации 10-3 М полностью нивелирует токсические процессы, вызванные воздействием меди (рис. 1).

 Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии-0

Рис. 1. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии различных концентраций сульфата меди и аллантоина и урата в концентрации А – 10-3 и В – 10-4 М.

При увеличении концентрации соли меди до 1000 мкМ, аллантоин не показывает достоверного снижения последствий воздействия тяжёлого металла. Урат, в свою очередь, в концентрации 10-3 М демонстрирует увеличение воздействия меди, что выражается в снижение скорости корневого роста (P < 0,05).

Сходное воздействие с сульфатом меди на скорость прорастания семян оказали ионы другого переходного металла – железа (рис. 2).

 Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии-1

Рис. 2. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии сульфата железа в концентрации 1000 мкМ и аллантоина и урата в концентрации 10-4 – 10-3 М.

Для проростков горчицы эффективной концентрацией кадмия является 50 мкМ соли данного вещества, при этом подавление скорости прорастания семян происходит более чем в четыре раза.

 Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии-2

Рис. 3. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии сульфата кадмия в концентрации 50 мкМ и аллантоина, урата в концентрации 10-4 – 10-3 М.

При прорастании семян в присутствие природных антиоксидантов – аллантоина и урата происходит, в среднем, одинаковое снижение последствий воздействия тяжёлого металла на длину корешков горчицы (рис. 3).



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.