WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной

-- [ Страница 1 ] --


На правах рукописи

ДЬЯКОНОВА Галина Вячеславовна

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2010

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных биологического факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Заслуженный деятель науки РФ, профессор

Проскуряков Марк Тихонович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колмакова Татьяна Сергеевна

кандидат технических наук, доцент

Рыльская Лариса Анатольевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита состоится «23» июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.212.208.07 по биологическим наукам в ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105/42, ауд. 203.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан «____» ____________ 20__ г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Основным источником их получения является поджелудочная железа и слизистая желудка крупного рогатого скота и свиней. Данный ресурс является ограниченным. Поэтому остается актуальным поиск новых продуцентов гидролаз, а также расширение знаний о свойствах таких ферментов. Особого внимания этот вопрос заслуживает в связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности протеиназ сычужного действия. Одной из перспективных групп являются базидиальные грибы. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереворазрушающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающих протеиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используемыми продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и Aspergyllus базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоношения в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических заболеваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактериальными культурами. Установлено, что гриб Irpex lacteus Fr. способен образовывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующего ферментного препарата и молочных продуктов с использованием данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых, культивируемых в промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.) обнаружены протеиназы, способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается по всему миру, не токсичен, а его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобным сырьем для получения ферментных препаратов.

Целью нашей работы являлось выделение, очистка и исследование физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), а также изучение возможности использования ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (опти­мумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Изучение возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна работы. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 – 40 кДа, которые находятся в состоянии проферментов и имеют точки изоэлектрофокусирования 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопротеиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором NaCl. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плодовых телах Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm обнаружена высокая молокосвертывающая активность, принадлежащая трем протеолитическим ферментам, два из которых являются металлопротеиназами, а один относится к классу сериновых протеиназ.



2. Молокосвертывающие ферменты гриба находятся в состоянии проферментов, автоактивация которых происходит в течение двух часов при 35 С и рН 6,01.

3. Молокосвертывающие ферменты вешенки обыкновенной при осаждении из экстракта 100 % раствором, насыщенным хлоридом натрия и рН 3,6 сохраняются в стабильном состоянии.

4. Молокосвертывающие ферменты из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной могут использоваться для получения сырного сгустка.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка Agaricales. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.

Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеи­наз. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертацион­ной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ – 2 статьи и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 90 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии (55 отечественных и 63 зарубежных источника). Диссертация содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом к данной работе послужили плодовые тела Вешенки обы­кновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm). Плодовые тела гомогенизировали без добавления жидкости при помощи ручного гомогенизатора, замораживали, затем размораживали однократно, отделяли экстракт путем фильтрации. Экстракт хранили при –18С не более 30 дней.

Определение количества растворимого белка в экстракте плодовых тел вешенки проводили по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). При проведении гельхроматографии, ионообменной хроматографии и изоэлектрического фокусирования для определения содержания белка во фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм (До­сон и др., 1991).

Молокосвертывающую активность на всех этапах исследования определяли по модифицированной методике Пятницкого (Пятницкий, Проскуряков, 1969); активность кислых протеиназ – по модифицированному методу Ансона (Нортроп и др., 1950); активность щелочных протеиназ – по методу Кунитца (Нортроп и др., 1950).

Молекулярные массы молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной определяли с помощью гель-хроматографии (Остерман, 1985) на колонке 1,9х75 см с сефадексом G-75 Superfine фирмы «Pharmacia» (Швеция), уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,0. Белки элюировали со скоростью 12 мл/ч, объем фракций 4 мл.

Для очистки молокосвертывающих протеиназ использовали метод ионо­обменной хроматографии на колонке 1,4х25 см. В качестве сор­бента применяли КМ-целлюлозу. Перед нанесением образца на колонку, ее уравновешивали 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4.

Метод изоэлектрического фокусирования (Ригетти, 1986) применяли для установления количества компонентов молокосвертывающей фракции белков экстракта вешенки обыкновенной и подбора условий для проведения ионообменной хроматографии.

Для установления типа строения активного центра использовали метод ингибиторного анализа. В ходе эксперимента применяли ФМСФ (ингибитор сериновых протеиназ), ЭДТА (ингибитор металлопротеиназ), моноиодацетат (ингибитор тиоловых ферментов) и пепстатин (ингибитор аспартильных протеиназ).

Для установления оптимумов рН активности и стабильности применяли универсальную буферную смесь (УБС) (Джорджеску, Пуэнеску, 1963) со значениями рН от 2 до 12 с интервалом в 0,5. рН доводили с помощью 1н раствора HCl и 1 н раствора NaOH.

Статистическая обработка результатов проводилась в программе STA­TISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной определяли содержание белка и оценивали протеолитическую активность по природным субстратам: казеину и молочно-ацетатной смеси. Согласно полученным нами данным, на один грамм сырых плодовых тел вешенки приходилось 9,40 ± 0,66 мг белка, 12,4±1,64 усл. Е казеинолитической активности (по методу Кунитца) и 3,22±0,66 усл. Е молокосвертывающей активности.

При дополнительном экстрагировании дистиллированной водой в соотношении 1:1 (по массе) была установлена молокосвертывающая активность, составившая около 20 % от ферментативной активности первого экстракта. С тем, чтобы определить оптимальные условия дополнительного экстрагирования, нами проведено исследование экстракции молокос­вертывающих ферментов при различных значениях рН экстрагирующей жидкости в диапазоне от 3 до 11 (рис. 1). Было установлено, что оптимальное значение рН экстрагирования молокосвертывающей активности находится в диапазоне от 6,8 до 7,3. Такая среда получается при экстрагировании дистиллированной водой.





 Зависимость молокосвертывающей активности в экстракте вешенки от рН-0

Рис. 1. Зависимость молокосвертывающей активности в экстракте вешенки от рН экстрагирующей жидкости.

* обозначены достоверные изменения (р0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

На основании полученных данных дальнейшие исследования проводили в объединенных экстрактах плодовых тел гриба.

В соответствии с этим, при оценке содержания белка в плодовых телах вешенки обыкновен­ной предполагали, что в единице массы плодовых тел гриба содержится столько же растворимого белка, сколько в экстракте, полученном из этой массы плодовых тел. Таким образом, согласно полученным нами данным, на один грамм сырой массы гриба плодовых тел вешенки обыкновенной приходилось 11,75 ± 0,66 мг белка.

При оценке общей протеолитической активности щелочных протеиназ по методу Кунитца в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной уста­новлено, что она составляла 15,50 ± 1,64 усл. Е казеинолитической активности на грамм сырой массы гриба. Такое стандартное отклонение можно объяснить тем, что активность протеи­наз изменяется в ходе дифференцировки плодовых тел, а в различных пар­тиях спорофоров вешенки могли находится плодовые тела разных стадий, причем их процентное соотношение в выборке могло несколько изменятся от партии к партии. Кроме того, в литературе отмечается, что активность фер­ментов базидиомицетов зависит от состава субстрата, на котором он выра­щен и от времени года, в которое проводился сбор (Горшина и др., 2003 с. 45.).

Молкосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной составила 4,03 ± 0,66 усл.Е/ г.сырого гриба.

Одним из важных показателей качества молокосвертывающего фер­ментного препарата является соотношение молокосвертывающей и протео­литической активности, так как при относительно высокой казеинолитической активности наблюдается не только формирование сгустка, но и дальнейший его гидролиз. Это приводит к появлению горьких пептидов и делает такой ферментный препарат не пригодным для использования в сыроделии. Для экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной, содержащего 11,75 ±0,66 мг белка, это соотношение было низко и составило 0,26, что в 12 раз ниже, чем у коммерческого препарата сычужного фермента (ТУ – 9219 – 002 – 05331581 – 98). В ходе дальнейшей работы проводились исследования с целью повышения данного соотношения. Для этого изучались условия, в которых наблюдалась максимальная молокосвертывающая активность и минимальная казеинолитическая.

Условия активации протеолитических ферментов в экстракте вешенки обыкновенной изучали при инкубации экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной с УБС в течение пяти часов при температуре 35С и значениях рН от 4,0 до 8,5 (рис.2).

 Зависимость молокосвертывающей активности от времени инкубации и рН-1

Рис. 2. Зависимость молокосвертывающей активности от времени инкубации и рН среды

* обозначены достоверные изменения (р0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Максимальная молокосвертывающая активность в экстракте отмечалась после 2 ч. преинкубации при 35С и рН 6,01. Эти данные позволили предположить наличие проферментов в экстракте плодовых тел гриба.

Следующий этап исследований был направлен на определение диапазона рН стабиль­ности протеолитической активности (по методу Кунитца) молокосвертывающих протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной (рис. 3). Для этого полностью активированный экстракт, полученный после 2 ч. инкубации при 35С и рН 6,01, смешивали с УБС рН в диапазоне от 3,0 до 10,0 с шагом 0,5.

 Зависимость протеолитической акти вности молокосвертывающих ферментов от-2Рис.3. Зависимость протеолитической акти вности молокосвертывающих ферментов от времени инкубации (при 35С) и рН среды.

* обозначены достоверные изменения (р0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Результаты этой части исследования показали, ферментативная активность экстракта незначительно изменяется в течение 3 ч инкубации при значениях рН, близких к 5,0, а наиболее резко снижается при рН 8,4 и 9,5.

Исследование стабильности молокосвертывающей активности (рис. 4) показало, что после 6 ч. инкубации в диапазоне значений рН от 3,0 до 8,0 в полностью активированном экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной сохраняется от 25 % до 30 % от исходной молокосвертывающей активности.

 Остаточная молокосвертывающая активность при различных рН экстракта-3

Рис. 4. Остаточная молокосвертывающая активность при различных рН экстракта после 6,5 ч. инкубации при 35С.

* обозначены достоверные изменения (р0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.