WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Амидированность и окислительные модификации белков тканей крыс и сывороточного альбумина при модельном и физиологическом старении

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Дурканаева Ольга Анатольевна

АМИДИРОВАННОСТЬ И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ ТКАНЕЙ КРЫС И СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА
ПРИ МОДЕЛЬНОМ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ СТАРЕНИИ

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2012

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии факультета биологических наук Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Лукаш Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горошинская Ирина Александровна

(г. Ростов-на-Дону)

доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Друккер Нина Александровна

(г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Институт биорегуляции
и геронтологии СЗО РАМН

(г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится «12» апреля 2012 г. в «13.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана (344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов–на–Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «____» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.208.07,

кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Старение – это комплексный биологический процесс, связанный с прогрессивным снижением физиологических и биохимических функций индивидуальных тканей или органов. Старение характеризуется «тетрадой»: поражением мембран, инактивацией ферментов, нарушением клеточного деления и накоплением балластных полимеров, включая нуклеиновые кислоты, липиды и белки (Обухова, Эмануэль, 1983). Особое значение в процессе старения имеет окислительный стресс, так как он носит прогрессирующий и нарастающий характер. Согласно свободно-радикальной теории старения, нарушение биологического механизма ингибирования свободно-радикального окисления может быть пусковым фактором для развития различных возраст-ассоциированных патологий и процессов старения. Анализ тканевых повреждений показывает, что в условиях возрастного дисбаланса про- и антиоксидантных систем белки являются одной из первичных мишеней для окислительного стресса. Окисленные модифицированные белки вовлекают в последующие процессы липиды клеточных мембран, что приводит к необратимым повреждениям клетки (Болдырев, 2003).

В клетках активные кислородные метаболиты (АКМ) вызывают различные повреждения белковых молекул, такие как окисление аминокислотных остатков, образование белок-белковых сшивок, фрагментация молекул. Взаимодействие белков со свободными радикалами и активными формами кислорода (АФК) приводит к образованию гидроперекисей, альдегидов и других реакционных соединений. Присутствующие в клетках ферменты репарации белков (протеиназы, протеазы, пептидазы) расщепляют поврежденные молекулы до аминокислот и низкомолекулярных продуктов с целью их повторного использования или выведения из организма. Содержание окислено модифицированных белковых соединений в клетках, органах или целом организме представляет собой удобный показатель для оценки развития окислительного стресса (Зенков и др., 2003).

Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки аспарагина и глутамина действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson, 2001). Было показано, что амиды дикарбоновых аминокислот вовлечены в процесс старения. Изменение степени амидированности влечет за собой локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Белизи и др., 2001; Бибов и др., 2004; Назарова и др., 2005; Robinson, 2002). Можно предположить, что между генетически предопределенными посттрансляционными модификациями (ПТМ) и интенсивностью индуцированных окислительных процессов, участвующих в молекулярных механизмах развития старения, существуют сложные многосторонние связи.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление взаимосвязи окислительных модификаций и степени амидированности тканевых и индивидуальных белков в условиях физиологического и модельного старения.

В работе решались следующие задачи:

  1. Изучить динамику степени амидированности суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.).
  2. Исследовать возрастную динамику окислительных модификаций суммарных белков по образованию карбонильных групп и уровню сульфгидрильных групп в различных тканях белых крыс.
  3. Разработать модифицированный способ получения очищенного препарата сывороточного альбумина (СА) крыс.
  4. Определить степень амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, содержанию сульфгидрильных групп, изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс.
  5. Изучить динамику амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана бычьего сывороточного альбумина (БСА) сразу и при инкубации в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37°С).
  6. Исследовать влияние концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степени деструкции БСА по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана и электрофоретической гетерогенности.
  7. Изучить влияние металл-катализируемых окислительных модификаций, индуцированных системой Фентона, на степень амидированности БСА.

Научная новизна работы: Впервые сопоставлена тканевая специфика степени амидированности и окислительных модификаций суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс разного постнатального возраста (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). Разработана новая, простая и экономичная модификация метода выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс. Впервые установлена зависимость степени амидированности сывороточного альбумина от условий индуцированного металл-катализируемого окисления в среде Фентона. Определены корреляционные связи между интенсивностью окислительных модификаций и степенью амидированности сывороточного альбумина в условиях физиологического и модельного старения.



Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Динамика степени амидированности и окислительной модификации суммарных белков при старении белых крыс индивидуальна для каждой из исследованных тканей.
  2. Инкубация в среде Фентона изменяет в БСА не только уровень окислительной модификации, но и содержание амидных групп.
  3. Старение БСА в условиях, моделирующих физиологические, приводит к изменению посттрансляционных модификаций и конформационным последствиям, сопоставимым с изменениями в СА крыс при их физиологическом старении.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярных механизмов, происходящих при старении белков как in vitro, так и in vivo.

В ходе старения животных наблюдается разнонаправленный характер изменений как степени амидированности, так и окислительных модификаций суммарных белков различных тканей крыс. Однако четкой зависимости между посттрансляционными модификациями суммарных белков различных тканей и их способностью к обновлению не выявлено.

В отличие от разнонаправленных динамик содержания амидных, карбонильных и сульфгидрильных групп в суммарных белках, отличающихся тканевой спецификой, посттрансляционные модификации индивидуального белка (сывороточного альбумина) имеют сходную картину как при физиологическом, так и при модельном старении.

Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между степенью амидированности и окислительными модификациями белков, выявляемые по содержанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о сопряжении спонтанных и индуцированных посттрансляционных модификаций, являющихся пусковым механизмом конформационных изменений белков, приводящих к нарушению их функциональной активности и накоплению во времени их аномальных, модифицированных форм.

Обнаруженная взаимосвязь между окислительной модификацией белка и степенью его амидированности имеет принципиальное значение, поскольку позволяет объяснить наблюдавшееся ранее увеличение амидированности белков в некоторых тканях при состояниях организма, сопряженных с окислительным стрессом.

Разработка модифицированного способа выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс позволяет упростить и сократить во времени базовый метод, не нанося ущерба степени чистота и гомогенности препарата.

Материалы, полученные в работе, используются на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета при чтении спецкурсов «Биология старения» и «Химия белка с основами биокатализа».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием, (Новосибирск, 2008); 8-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008); Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2008); 3-й Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); 9-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. «Биология – Наука 21-го века» (Пущино, 2010); 2-й Международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011); Юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011).





Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 0,8 п.л., личный вклад – 57,3%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литература, включающего 97 отечественных и 114 зарубежных источников. Работа иллюстрирована
43 таблицами, 2 схемами и 52 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на базе лабораторий «Молекулярной биотехнологии» и «Экспериментальной биохимии» кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета.

Работа выполнена на 83 белых беспородных крысах – самцах в возрасте 2, 4, 16, 18, 20 и 24 месяцев. Животные содержались в условиях вивария на стандартном рационе, доступ к воде и пище был свободным. При обнаружении у крыс опухолевого роста или воспалительных процессов их исключали из опыта.

Общая схема эксперимента состояла из 4 этапов. На первом этапе работы определяли степени амидированности и окислительных модификаций (уровень карбонилирования и содержание SH-групп) в суммарных белках тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). На следующем этапе работы по степени амидированности, уровням карбонильных и сульфгидрильных групп, а также изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана высокоочищенного сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс были изучены молекулярные механизмы старения белковых структур in vivo. На третьем этапе исследовали влияния концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степень деструкции БСА (по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана, электрофоретической гетерогенности). На заключительном этапе работы анализировали динамики амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана БСА сразу и при инкубации в стерильных условиях в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37°С).

Выделение и очистку тканевых белков проводили методом Yoshino (1970) и Wherrett (1971) в модификации Н.В. Пушкиной (Шепотиновская, 1982). Количество белка в полученных препаратах определяли методом Lowry (1951) в модификации Schaterle (1973).

Выделение и хроматографическую очистку препаратов сывороточного альбумина молодых и старых крыс проводили методом Angal (1977), основанном на аффинном сродстве альбумина к триазиновому красителю (цибакроновому синему), иммобилизованному на агарозе, с некоторыми модификациями, включающими использование предварительного дробного высаливания сульфатом аммония.

Полученный сывороточный альбумин крыс идентифицировали с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) по Леймли (Laemmli, 1970).

Регистрировали спектры собственной флуоресценции при длинах волн возбуждения 275, 280 и 285 нм. Длины волн 275 нм и 285 нм соответствуют максимумам поглощения остатков тирозина (Тир) и триптофана (Трп), соответственно, а излучение с длиной волны 280 нм относится к области перекрывания спектров поглощения остатков Тир, Трп и фенилаланина (Фен). Окислительную модификацию тирозиновых остатков регистрировали по образованию битирозина, обладающего характерной голубой флуоресценцией при возб 325 нм и исп 415 нм. Окисление триптофановых остатков определяли по изменению флуоресценции, характерной для триптофана ( возб 295 нм и исп 340нм).

Определение содержания карбонильных групп белков проводили спектро-фотометрическим динитрофенилгидразиновым методом (Дубинина, 1995).

Определение сульфгидрильных групп в белках осуществляли колориметрическим методом при помощи 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (Веревкина, 1977).

Определение содержания амидных групп белков проводили флуорометрическим методом (Sugawara, 1981) в модификации (Шепотиновская, 1995), в основе которого лежит специфическая для аммиака флюоресценция, возникающая в результате его взаимодействия с ортофталевым альдегидом в присутствии дитиотреитола. О содержании амидных групп в белке судили по количеству выделенного аммиака после гидролиза препарата белка в 1 н. серной кислоте при 100°С. В белках определяли суммарную амидированность (САГ), легкогидролизуемые (ЛАГ) и трудногидролизуемые (ТАГ) амидные группы (Гершенович, Кричевская, 1960).

При изучении «старения» белков in vitro материалом исследования являлся лиофилизированный препарат бычьего сывороточного альбумина фирмы «ДиаМ» (Россия), растворенный в физиологическом растворе (0,9% NaCl). Стерилизацию белковых препаратов (1 мг/мл) осуществляли с использованием бактериальных фильтров с внутренним диаметром пор 0,22 мкм («Schleicher Schll», Германия), а затем добавляли мертиолят натрия в конечной концентрации 0,001%.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.