WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |

Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. поиск новых противовирусных средств.

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АДИЕВА АЙНА АХМЕДОВНА



РОЛЬ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОЛОГИИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО. ПОИСК НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ.


03.00.06. – Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009 г.

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук, КУЩ

профессор Алла Александровна

доктор медицинских наук, НИСЕВИЧ

профессор Лика Львовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, МИЛЛЕР

профессор Галина Генриховна

доктор биологических наук БРАГИНА

профессор Елизавета Ефимовна

доктор медицинских наук, ЧЕШИК

профессор Святослав Георгиевич

Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Научного гематологического центра РАМН



Защита состоится «___» _______________ 2009 г. в ____часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан «___» __________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, БУРЦЕВА

доктор медицинских наук Елена Ивановна

Список использованных сокращений

АГ антиген

АПФ – аминокислотные производные фуллерена С60

АТ – антитело

БКМ быстрый культуральный метод

БОЕ – бляшкообразующая единица

ВКЖ – вируссодержащая культуральная жидкость

ВПР – врожденные пороки развития

ВУИ – внутриутробное инфицирование

ГВИ – герпесвирусные инфекции

ГЦВ - ганцикловир

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА – индекс авидности

ИППП – инфекции, передаваемые половым путем

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФН – интерферон

МИ – множественность инфицирования

МКА – моноклональные антитела

ОАГА – осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА поликлональные антитела

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

РИФ (РНИФ) реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции

УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ – фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ – химиотерапевтический индекс

ЦД – цитотоксическая доза

ЦМВ – цитомегаловирус человека

ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция

ЦНС – центральная нервная система

ЦПД – цитопатическое действие

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий – высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.



На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008], описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G1 – периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии G2 в М, в точке, обозначаемой как G2/М [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели, а также для выбора адекватной терапевтической тактики новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С60; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

  1. Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.
  2. Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.
  3. Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.
  4. Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.
  5. Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.
  6. Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С60 (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.
  7. Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.
  8. Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна.

  1. Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.
  2. Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.
  3. Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни – инфекционно активный ЦМВ.
  4. Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С60 – натриевой соли аминокапроновой кислоты (С60-Na-АКК) и натриевой соли аминомасляной кислоты (С60-Na-АМК); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для С60-Na-АКК равен 260-2600; для С60-Na-АМК – 2500-5450.
  5. Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК, при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.
  6. Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

Практическая значимость.





На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования недоношенных новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела до года.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент – ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ. Сравнительная оценка различных методов лабораторной диагностики при анализе структуры перинатальной патологии и смерти способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с герпесвирусами, а также повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. – Москва, 2008.

Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 9 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.